Coloração de gotículas lipídicas de enócitos larvais de Drosophila: uma técnica para avaliação do acúmulo de gotículas lipídicas em condições normais e estressadas usando corante à base de BODIPY

Resumo

Fonte: Wei, C., et al., Dissecção e coloração de gotículas lipídicas de enócitos em larvas de Drosophila. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra a coloração de gotículas lipídicas em enócitos larvais de Drosophila - células semelhantes a hepatócitos - usando o corante fluorescente lipofílico à base de BODIPY. Essas células atuam como um modelo para estudar o metabolismo lipídico durante o desenvolvimento e em resposta ao estresse ambiental, como a fome.

Protocolo

1. Tratamento de fome para as larvas

NOTA: Nas larvas de terceiro ínstar, existem poucas ou nenhumas gotículas lipídicas detectáveis nos enócitos em condições normais de alimentação, mas numerosas gotículas lipídicas grandes podem ser induzidas nos enócitos em condições de estresse, como fome. Para verificar ainda mais este método, é necessário pré-tratar essas larvas para induzir a biogênese de gotículas lipídicas em oenócitos. Aqui, um curso de tempo de fome de 12 h, 24 h e 36 h foi escolhido como paradigma. Em particular, um curto período de fome (por exemplo, 3 h) é suficiente para induzir gotículas lipídicas detectáveis nos enócitos. A duração da fome pode variar de acordo com objetivos e configurações experimentais específicas.

1. Faça câmaras para tratamentos de fome e controle.
   1. Para câmaras de tratamento de fome: coloque um papel de filtro de tamanho apropriado em uma placa de Petri de 6 cm e pipete 1 mL de PBS no papel de filtro.
   2. Para câmaras de tratamento de controle: coloque 5 mL de fubá padrão Bloomington na placa de Petri.
2. Use uma espátula para desenterrar suavemente a camada superior do alimento contendo larvas que ainda estão se enterrando no alimento e transfira-as para uma placa de Petri cheia de 5 mL de PBS. Mexa suavemente as larvas em PBS para remover qualquer contaminação alimentar das larvas e torná-las o mais limpas possível.
3. Use um pincel pequeno para coletar 40 larvas de terceiro ínstar do mesmo tamanho aproximado. Separe-os aleatoriamente em uma câmara de fome ou controle, com 20 larvas cada.
4. Colocar as câmaras na incubadora a 25 °C com 60% de umidade e permitir o desenvolvimento por 12 h, 24 h e 36 h de tratamento.
   NOTA: Para as larvas na câmara de fome, adicione 1 mL de PBS a cada 12 h para evitar a desidratação das larvas.

2. Dissecção de enócitos

1. Use um pincel pequeno para coletar larvas da idade apropriada (12 h, 24 h ou 36 h após o tratamento) e, em seguida, transfira-as para uma nova placa de Petri cheia de 5 mL de PBS gelado para lavar.
   NOTA: Repita a etapa 2.2 ao lidar com larvas em uma câmara de controle para remover qualquer contaminação de alimentos.
2. Encha uma placa de dissecção com PBS gelado e use uma pinça para transferir suavemente as larvas para a placa de dissecação. Coloque a placa de dissecção sob um microscópio estéreo para a etapa de dissecção seguinte.
   NOTA: A temperatura gelada ajudará a retardar os movimentos das larvas e facilitará a dissecação.
3. Vire as larvas com o lado ventral para cima e o lado dorsal para baixo e segure suavemente no lugar usando uma pinça. Prenda as larvas à placa de dissecação colocando um pino de dissecção na faringe na extremidade anterior e outro pino no espiráculo na extremidade posterior.
   NOTA: O lado dorsal é mais facilmente identificado pela presença dos troncos dorsais da traqueia.
4. Use uma tesoura de mola Vannas para incisar (longitudinalmente) através da epiderme da extremidade anterior para a posterior.
5. Remova o tecido interno da epiderme usando uma pinça.
   NOTA: Deve-se ter cuidado ao remover os ramos traqueais para evitar danos aos enócitos, que estão localizados na superfície interna da epiderme.
6. Com uma pinça, recupere os pinos de dissecção e transfira a epiderme para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL preenchido com PBS no gelo.
7. Continue a dissecar outras larvas seguindo o procedimento descrito acima.

3. Coloração de gotículas lipídicas

1. Incubar a epiderme dissecada no tampão de fixação por 30 min em temperatura ambiente (TR) em um rotador.
   nota: O tampão de fixação contém 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS.
2. Remova o tampão de fixação, seguido de uma lavagem rápida. Para realizar uma lavagem rápida, adicione 1 mL de PBS em RT no tubo após a remoção do PFA, ressuspenda suavemente os tecidos e descarte o PBS.
   cuidado: O tampão de fixação contém PFA, que é prejudicial à saúde humana. É importante descartar adequadamente o tampão de fixação como resíduo perigoso.
3. Lave as amostras 3x por 5 min cada com PBS para lavar todos os resíduos de PFA possíveis.
4. Incubar a epiderme com BODIPY 493/503 (1 μg/mL; ver tabela de materiais) por 30 min em RT em um rotador.
   nota: A partir desta etapa, envolva o tubo da microcentrífuga com um pedaço de papel alumínio para proteger as amostras da luz e minimizar o possível fotobranqueamento.
5. Remova a solução de coloração BODIPY 493/503 e lave as amostras 3x por 10 min cada com PBS para remover completamente os corantes residuais.

4. Montagem e imagem

1. Coloque 6 μL de meio de montagem em uma lâmina de microscópio limpa.
   nota: O meio de montagem é usado para um tempo de detecção mais longo com base em suas propriedades antifade.
2. Use uma pinça para pegar uma epiderme e remova suavemente o PBS residual com um lenço.
3. Coloque a epiderme no meio de montagem e ajuste sua orientação de modo que sua superfície interna contendo os enócitos fique na parte inferior e sua superfície externa na parte superior.
4. Coloque suavemente uma lamínula na epiderme.
   nota: Remova qualquer meio de montagem extra que vaze sob a lamínula com um pano, se necessário. Para facilitar a imagem, empurre suavemente a lamínula com uma pinça para que, ao observar a lâmina através do microscópio, o aglomerado de enócitos possa ser facilmente visualizado em um único plano. Alternativamente, é praticável cortar a epiderme em duas semi-epidermes através da linha média para evitar o enrolamento de toda a epiderme ao montar os tecidos.
5. Aplique esmalte transparente nas bordas da lamínula para selar.
6. Coloque os slides em uma caixa de amostra à prova de luz e deixe o esmalte secar em RT, o que pode levar de 5 a 10 minutos.
7. Prossiga com a análise microscópica. Tire imagens usando um microscópio confocal (ampliação de 63x com configurações de filtro GFP ou FITC otimizadas, excitação = 488 nm, emissão = 503 nm) para adquirir sinais limpos e sensíveis com fundo minimizado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de centrífuga de 50 mL	Corning	430829	50 mL
Placa de Petri de 6 cm	Thermo Fisher	150326	6 cm
Ágar			Para comida de mosca
Folha de alumínio	N/A	N/A	Proteja o smaple da luz
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	Corante de coloração de gotículas lipídicas
Microscópio confocal	Leica	Leica TSC SP5	Imagem confocal
xarope de milho			Para comida de mosca
fubá			Para comida de mosca
Lamela	Citoglas	10212424C	20 × 20 mm, 0,13-0,17 de espessura
Pino de dissecção	N/A	N/A
Placa de dissecção	N/A	N/A
Papel de filtro	N/A	N/A	Diâmetro: 11 cm
Tampão de fixação	N/A	N/A	Paraformaldeído (PFA) a 4% em 1x Pbs
Pinça	Dumont	11252-30	#5
incubadora	Jiangnan	SPX-380	Para cultura de moscas
Tubo de microcentrífuga	Axygen	MCT-150-C	1,5 mL
Lâmina de microscopia	Citoglas	10127105P-G
Meio de montagem	Montagem VECTASHIELDAntifade Média	H-1000	Meio de montagem antidesbotamento
esmalte	Panera	AAPR419	Sele a lamínula
pincel	N/A	N/A
Pbs	N/A	N/A	1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na_{2} HPO_{4} ,1,8 mM KH_{2} PO_{4} , pH 7,4)
Rotator	Instrumentos de laboratório Kylin-Bell	WH-986
Tesoura	Smartdata Médico	SR81	Tesoura de mola Vannas
Farinha de soja			Para comida de mosca
espátula	N/A	N/A
Comida padrão de fubá	N/A	N/A	De acordo com o padrão Bloomington Receita de comida de fubá
Microscópio estéreo	Leica	Leica S6E	Para dissecção de tecidos
Limpe o papel	N/A	N/A
levedura			Para comida de mosca