1. Solução de coloração LCO
NOTA: Se o hFTAA for adquirido de um fornecedor comercial, siga as instruções do fornecedor em vez da seção 1.
- Ressuspenda o hFTAA liofilizado em NaOH 2 mM para preparar uma solução estoque de 1 mg / mL. Conservar a massa num frasco para injetáveis de vidro a 4 °C. O estoque pode ser armazenado por um ano.
- No dia da coloração, prepare uma solução de trabalho diluindo o estoque 1:10.000 em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
2. Preparação de Amostras de Tecido
NOTA: Muitos tipos de tecido podem ser visualizados usando hFTAA como marcador amilóide. Veja a Figura 1 para exemplos. hFTAA é sensível à conformação agregada. A coloração deve, portanto, ser realizada preferencialmente em agregados ininterruptos sem exposição de epítopos. A qualidade espectral ideal é alcançada se a fixação do tecido for mantida no mínimo. Portanto, o material fresco congelado, suavemente fixado em etanol no momento da coloração, é preferido. No entanto, é possível detectar depósitos de amilóide também no tecido que foi fixado com, por exemplo, formalina. A hFTAA geralmente penetra bem no tecido. Selecione uma espessura de amostra compatível com a técnica de imagem pretendida.
- Se forem usadas seções fixadas em formalina e embebidas em parafina, desparafinizadas em xileno durante a noite. Mergulhe as seções em banhos consecutivos de etanol 99%, etanol 70%, dH2O e PBS, 10 min em cada. Deixe as seções de tecido secarem em condições ambientais. Cuidado: O xileno é sempre manuseado em uma capela de exaustão química. O xileno e outros solventes orgânicos são prejudiciais.
- Descongele as criossecções em temperatura ambiente. Fixe as seções de tecido em formalina a 10% durante a noite e reidrate-as mergulhando-as em banhos consecutivos de etanol a 99%, etanol a 70%, dH2O e PBS, 10 min em cada. Deixe as seções de tecido secarem em condições ambientais.
- Adicione gotículas da solução de trabalho hFTAA (aproximadamente 200 μL) às seções de tecido para cobri-la. A gota deve permanecer no lugar por tensão superficial. Incube por 30 min em temperatura ambiente para coloração.
- Enxágue a solução de coloração com 500 μL de PBS usando uma pipeta e, em seguida, mergulhe a lâmina no banho de PBS por 10 min. Deixe a seção secar em condições ambientais.
- Monte usando o meio de montagem de fluorescência. Deixe o meio de montagem assentar durante a noite.
NOTA: A coloração hFTAA pode ser realizada em combinação com outros métodos de coloração, como imunofluorescência, marcadores específicos de células ou organelas, etc. Para realizar a cocoloração, execute o protocolo de coloração completo de sua escolha e adicione a coloração hFTAA no final, a partir da etapa 2.2. Veja a Figura 2 para exemplos. Para imunofluorescência, selecione preferencialmente um anticorpo secundário que seja excitado a 640 nm ou mais. Nesta faixa de comprimento de onda, hFTAA não absorve e, portanto, não pode ser excitado e não fluoresce. Isso garante que nenhum sangramento seja observado entre hFTAA e anticorpo.
