Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação
- Gerar camundongos com deleção de aves de rapina específicos para osteoclastos (Raptorfl/fl; Ctsk-cre, doravante RapCtsk) acasalando camundongos Raptorfl / fl com camundongos Ctsk-cre. Use os camundongos Raptorfl / fl como controle WT neste estudo.
- Tenha um recipiente com gelo para manter o osso isolado.
- Prepare o meio de cultura.
- Prepare o meio de cultura α-MEM suplementando o meio essencial mínimo alfa (α-MEM) com 1x glutamina, penicilina-estreptomicina e 10% de soro fetal de bezerro.
- Prepare o meio de indução de macrófagos da medula óssea consistindo de 50 mL de meio α-MEM e M-CSF a 20 ng/mL.
- Prepare o meio de indução de osteoclastos consistindo de M-CSF e RANKL a 20 ng/mL, respectivamente, em 50 mL de meio α-MEM.
- Prepare os seguintes tampões antes da coloração TRAP.
- Prepare a solução fixa consistindo de 6,5 mL de acetona, 2,5 mL de solução de citrato e 0,8 mL de solução de formaldeído a 37% (vol / vol).
- Prepare a solução de coloração TRAP.
- Pré-aqueça a água deionizada a 37 °C.
- Adicione 100 μL de solução de base GBC de granada rápida e 100 μL de solução de nitrito de sódio em um microtubo de 1,5 mL e misture por inversão suave por 30 s. Deixe a mistura repousar por 2 min.
- Pré-aqueça 9 mL de água deionizada a 37 ° C. Adicione 200 μL de solução de base GBC de granada rápida diazotizada da etapa 1.4.2.2, 100 μL de solução de fosfato de naftol AS-BI, 400 μL de solução de acetato e 200 μL de solução de tartarato.
- Manter a solução da mistura de coloração TRAP em banho-maria a 37 °C.
2. Dissecção (Dia-1)
- Eutanasiar 3 camundongos WT e RapCtsk fêmeas de um mês de idade por CO2 separadamente. Realize a inalação de CO2 com equipamento apropriado por pessoal treinado.
- Mergulhe 6 camundongos em um béquer com 100 mL de etanol a 75% (vol / vol) por 5 min para evitar contaminação bacteriana e, em seguida, coloque em uma placa de dissecção em decúbito dorsal. Faça uma incisão na distal da tíbia verticalmente e disseque a pele ao longo do membro posterior com uma tesoura oftálmica.
- Corte o ligamento articular da articulação do quadril com uma tesoura e desloque os membros posteriores do tronco.
- Corte o ligamento articular da articulação do joelho e dissocie cuidadosamente a tíbia e o fêmur da articulação do joelho. Remova suavemente o tecido mole com uma tesoura.
- Coloque todos os ossos de um genótipo em um camundongo em cada poço de uma placa de seis poços com 2 mL de α-MEM em gelo.
nota: Para preservar a viabilidade celular, o osso deve ser mantido nessas condições por menos de 1 h.
3. Isolamento (Dia 1)
- Encha um poço de uma placa de seis poços com etanol a 75% (3 mL) e os outros 5 poços com meio α-MEM (3 mL).
- Colocar todos os ossos de um genótipo na lavagem com etanol durante 15 s e lavar os ossos 5 vezes com meio α-MEM durante 10 s de cada vez.
- Corte as epífises com a tesoura e insira uma agulha de seringa de 0,45 mm na cavidade óssea e lave a medula com meio α-MEM em um tubo de centrífuga de 50 mL.
- Lave a cavidade óssea usando o mesmo método da outra extremidade do osso. Repita pelo menos duas vezes para lavar bem a cavidade óssea até que o osso esteja pálido.
- Centrifugar a medula óssea para obter um sedimento celular a 800 x g e 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante.
- Adicione 3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos no tubo de centrífuga e pipete suavemente para ressuspender a medula óssea. Mantenha o tubo da centrífuga no gelo por 8 minutos para lisar os glóbulos vermelhos.
- Adicione 6 mL de meio α-MEM no tubo de centrífuga para interromper a lise celular. Centrifugar a 500 x g e 4 °C durante 10 min e aspirar o sobrenadante.
- Ressuspenda em 3 mL de meio de cultura α-MEM e coloque as células em uma placa de seis poços (geralmente um camundongo por poço).
- Incubar a 37 °C em uma incubadora de CO5% 2 durante a noite.
4. Revestimento (Dia 0)
- Transfira o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 15 mL para coletar as células soltas na manhã seguinte.
- Centrifugar a 800 x g e 4 °C durante 5 min e aspirar o sobrenadante.
- Ressuspender em 4 ml de meio de cultura α-MEM.
- Pegue 20 μL da solução celular e misture com 20 μL de Trypan Blue. Adicione 10 μL da mistura à câmara de contagem e obtenha a contagem de células por mL de solução.
- Adicione um volume apropriado de meio de cultura α-MEM para obter uma solução celular de 500.000 células/mL.
- Adicione 500 μL e 50 μL de meio de indução de macrófagos da medula óssea em cada poço de uma placa de 24 poços e uma placa de 96 poços, respectivamente.
- Adicione 500 μL e 50 μL de solução celular em cada poço de uma placa de 24 poços e uma placa de 96 poços, respectivamente.
- Incubar a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2 por 3 dias.
5. Diferenciação (Dias 3-7)
- Três dias após o plaqueamento, recolher 50 μL de meio de cada alvéolo da placa de 96 poços e congelar a -20 °C e, em seguida, aspirar o meio residual.
- Adicione 1 mL e 100 μL de meio de indução de osteoclastos em cada poço de uma placa de 24 poços e uma placa de 96 poços, respectivamente.
- Incubar a 37 °C durante 2 dias.
- Coletar 50 μL de meio de cada alvéolo e aspirar o meio residual.
- Adicione meio de indução de osteoclastos em cada poço.
- Incubar a 37 °C por 1 dia.
nota: Nesse momento, osteoclastos grandes e multinucleados devem ser vistos ao microscópio invertido (Figura 1A).
- Se os osteoclastos não forem vistos, troque o meio de indução dos osteoclastos e observe diariamente até que os osteoclastos sejam vistos.
- Colete 50 μL de meio de cada poço da placa de 96 poços após a formação dos osteoclastos.
6. Coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP)
NOTA: Osteoclastos maduros podem estar presentes após 6-7 dias de cultura in vitro (etapa 4).
- Aspire médio e lave suavemente 3 vezes com 1x PBS.
- Fixe as células em cada poço da placa de 96 poços com 100 μL de solução fixa por 30 s à temperatura ambiente.
- Após a fixação, aspire a solução fixa e lave suavemente 3 vezes com água deionizada pré-aquecida a 37 °C. Aspire a água deionizada.
- Adicione 100 μL de coloração TRAP em cada poço da placa de 96 poços e coloque a placa em uma incubadora a 37 ° C por 30 min e proteja-a da luz.
- Após a coloração, aspire a mancha TRAP e lave suavemente 3 vezes com água deionizada.
- Osteoclastos de imagem usando um microscópio invertido com ampliação de 40X.
