Coloração com vermelho de alizarina: uma técnica para visualizar a mineralização por osteoblastos cultivados

Resumo

Fonte: Kampleitner, C., et al. Perfil de Compatibilidade Biológica em Biomateriais para Regeneração Óssea. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra uma técnica de coloração para detectar a extensão da mineralização ou deposição de cálcio em osteoblastos primários cultivados usando corante vermelho de alizarina.

Protocolo

1. Mineralização de osteoblastos (OB) avaliada por coloração com Vermelho de Alizarina S (ARS)

1. Adicione osteoblastos primários (OBs) aos discos de fosfato β-tricálcico (β-TCP) usados como um andaime biocompatível em uma placa de cultura.
2. Aspire o meio de cultura dos poços contendo OBs primários 14 dias após a adição do meio de mineralização e enxágue duas vezes com 0,5 mL de 1x PBS em RT. Aspire o PBS e fixe as células adicionando 0,5 mL da solução de formalina tamponada a 10% em RT por 10 min.
3. Aspire a formalina tamponada a 10% com uma pipeta descartável e lave duas vezes com 0,5 mL de água ultrapura.
4. Aos OBs fixos, adicione 0,25 mL de solução de coloração ARS 40 mM (pH 4,2) dissolvida em água ultrapura e incube a placa em RT por 10 min em um agitador a 100 shakes / min.
5. Aspire a solução de coloração com uma pipeta de uso único e enxágue com 1 mL de água ultrapura. Repita esta etapa de 5 a 10 vezes para remover manchas inespecíficas.
   nota: A solução de enxágue deve ser sem cor.
6. Aspire a água ultrapura e adicione 1 mL de PBS frio. Incubar a placa em RT durante 10 min num shaker a 100 batidos/min.
7. Aspire o PBS, transfira os discos β-TCP corados para um novo poço e escaneie as placas com um scanner de mesa para registrar a mineralização.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Discos de fosfato β-tricálcico (β-TCP, 14 mm)			Os discos foram sinterizados em mufla a uma temperatura de 1150 °C. Uma descrição detalhada da produção pode ser encontrada em Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). As amostras foram irradiadas com UV (15 min para cada lado) antes de serem usadas em culturas de células.
Espuma Orthovita Vitoss (espuma β-TCP/C)	Orthovita	2102-1405
Vermelho de alizarina S	Sigma-Aldrich	Rolamento A5533
Solução de formalina tamponada neutra a 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Meio de mineralização osteogênica (MM)			α-MEM + 10% de FBS inativado por calor + 1% de penicilina-estreptomicina + 50 μg/mL de ácido ascórbico + 5 mM de β-glicerofosfato
Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Água ultrapura: água de cultura de células livre de pirogênio	VWR	L0970-500
Tampão de lavagem			Adicione 0,05% de Tween20 a 1x PBS.
Placa de cultura de suspensão de 24 poços	Greiner bio-one	662102
Scanner de mesa: Epson Perfection 1200 Photo	Epson
Pipeta descartável: pipeta de soro	Greiner bio-one	612301
água destilada	Carl Roth	3478.4
Pipeta descartável: pipeta de soro	Greiner bio-one	612301