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1. Protocolo de coloração de prata
- Prepare todas as soluções necessárias para a coloração de prata com antecedência (Tabela 1).
nota: Não toque diretamente no gel PAGE até que ele tenha sido corado, revelado e colocado em solução de parada. Em vez disso, manipule o gel usando ferramentas limpas de plástico ou vidro. O manuseio direto do gel resultará em distorções da impressão digital e outros artefatos visíveis no gel após a coloração.
- Quando a execução estiver concluída, desmonte o e extraia o gel em um recipiente limpo, médio-grande, cheio de água filtrada e deionizada.
nota: Para evitar o manuseio direto do gel, use a ponta da pipeta ou outro objeto de plástico para retirar suavemente o gel do enquanto estiver submerso em água. O gel pode ser frágil - manuseie com cuidado.
- Descarte a água. Manchar o gel em solução de coloração azul de Alcian durante 5 min.
- Descarte a mancha azul Alcian. Enxágue / lave rapidamente 2-3x com água filtrada e deionizada até que a maior parte da solução de coloração azul de Alcian tenha sido removida.
- Deixe desmanchar em água deionizada e filtrada durante a noite no balancim. Certifique-se de que haja um amplo volume de água filtrada e deionizada para garantir que qualquer mancha residual seja totalmente removida do gel durante a noite.
- Lave o gel em metanol a 50% (40 min no total, troque a solução 2-3x).
- Lave o gel em água filtrada e deionizada por 30 min. Descarte a água e repita mais 3 vezes por um total de 2 h, substituindo a água a cada vez.
- Em um recipiente fresco e limpo, manche o gel por 30 min em solução de coloração de nitrato de prata.
- Enxágue/lave rapidamente 2-3x em água filtrada e deionizada para remover completamente a solução de coloração de prata.
- Lave por 30 min em água deionizada e filtrada. Descarte a água e repita 2x por um total de 90 min, substituindo o banho-maria a cada vez.
- Descarte a água e adicione a solução de revelação.
- Depois de adicionar a solução de revelação, observe cuidadosamente o gel e observe o aparecimento de bandas. Dependendo da qualidade da mancha e da massa da amostra carregada, o desenvolvimento pode levar de alguns segundos a vários minutos.
- Assim que as bandas desejadas estiverem visíveis, descarte imediatamente a solução reveladora e lave brevemente com a solução de parada.
- Descarte a lavagem da solução de parada e substitua por uma solução de parada nova. Deixe de molho por 1 h em uma cadeira de balanço ou shaker.
- Lave em água desionizada e filtrada durante a noite (no entanto, o gel pode ser visualizado imediatamente após a lavagem da solução de parada).
Tabela 1: Soluções necessárias para coloração de prata de glicosaminoglicanos separados por eletroforese em gel de poliacrilamida. Todas as soluções devem ser filtradas (0,22 μm) antes do uso.
| NOTA: Todas as soluções devem ser filtradas (0.22μm) antes do uso. |
| solução | receita | composição | Comentários |
| Solução de coloração azul de Alcian (500mL) | Pó azul Alcian 8GX | 2,5 ouros | Concentração desejada: 0,5% p/v |
| 2% v/v de ácido acético glacial | 500mL | |
| Mancha prateada (200 mL) | Água deionizada | 192,7 ml | Prepare a solução de mancha fresca; use dentro de uma semana. |
| Hidróxido de sódio 7.6M | 2 mL | Para fazer, adicione 3,04g de grânulos de hidróxido de sódio a 10 mL de água |
| Hidróxido de amônio | 3,3 ml | |
| Solução de nitrato de prata 4M | 2 mL | Para fazer, adicione 3.397 g de nitrato de prata a 5 mL de água. Adicione gota a gota enquanto mexe para evitar precipitação. |
| Solução em desenvolvimento (501 mL) | Água deionizada | 500 mL | A solução de revelação deve ser feita fresca e usada dentro de 24 h. |
| 2,5% p/v de ácido cítrico | 1 mL | Para fazer, adicione 100mg a 4 mL de água deionizada. O ácido cítrico deve ser feito fresco. |
| Formaldeído | 250μL | |
| Solução de parada (500 mL) | Água deionizada | 300 mL | |
| Ácido acético glacial | 20 mL | |
| metanol | 90 mL | |