Coloração de Giemsa para Ensaio de Formação de Colônias: Um Procedimento de Coloração In Vitro para Avaliar a Capacidade Proliferativa de Células-Tronco Mesenquimais

Resumo

Fonte: Schlaefli, P. et al. Um método enzimático para resgatar células-tronco mesenquimais de amostras de medula óssea coagulada. J. Vis. Exp. (2015)

Neste vídeo, demonstramos o procedimento de coloração de Giemsa para avaliar o potencial proliferativo das células-tronco mesenquimais para formar colônias viáveis. A coloração de Giemsa é uma coloração neutra composta principalmente de corantes azul e eosina, que carregam afinidade seletiva por componentes celulares, dependendo de sua carga.

Protocolo

1. Semeadura para Cultura de Células de Expansão e Placas CFU

1. Ressuspender as células (constituídas por eritrócitos e células mononucleares) em 50 ml de meio basal: Alfa-MEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina e 2,5 mg/ml de anfotericina B. Contar as células diluídas a 1:10 em solução de Trypan Blue utilizando uma câmara de Neubauer.
2. Plaquear as células em frascos de cultura de células com a densidade de 5 x 10⁷ células/cm² e incubar numa incubadora humidificada a 37 °C. Se disponível, use condições hipóxicas (5% de oxigênio). Para o controlo do ensaio de UFC, colocar células 10⁹ numa placa de cultura de células de 10 cm de diâmetro.
3. Após 3 dias de cultura, as células-tronco mesenquimais são anexadas à placa de cultura de células enquanto outras células permanecem em suspensão. Troque o meio com meio basal suplementado com 5 ng/ml de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF). Para o controle do ensaio de UFC, trate a placa de cultura de células da mesma forma.
4. Continuar a cultura celular durante um total de 2 semanas, trocando meios três vezes por semana. Se as células excederem 80% de confluência, divididas por tripsinização. Para o controle do ensaio CFU, troque a mídia da mesma forma, mas não divida as células ao longo das duas semanas.

2. Coloração de Giemsa para Ensaio de UFC

1. Preparar 10 ml de solução de Giemsa por cápsula: diluir a solução-mãe (7,6 g/l de Giemsa em glicerol:metanol) 1:10 em água estéril (preparar sempre uma nova diluição de trabalho).
2. Remova o meio da placa de cultura de células e lave as células com PBS. Seja muito cauteloso ao aplicar líquido na placa de Petri e evite lavar as células.
3. Fixe as células em metanol puro por 5 min em RT. Descarte o metanol. Adicionar a solução de Giemsa e incubar durante 60 min numa incubadora humidificada a 37 °C.
4. Lave duas vezes com PBS. Seque o prato ao ar primeiro em uma toalha de papel. Conte as colônias manualmente. Isso é melhor alcançado usando uma caneta marcadora na parte de trás da placa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Componentes do meio basal
PenStrep 100X	Gibco	15140122
FGF-básico humano	Peprotech	100-18B
MEM Alpha com Nucleosídeo, com Glutamina estável	Amimed	1-23S50-I
FBS Calor Inativado	Amimed	2-01F36-I
Anfotericina B	Aplicativo	A1907
genérico
Pbs	Aplicativo	964,91
Mancha de Giemsa	Aplicativo	A0885
Consumíveis
Prato de cutura de células primárias	falcão	353803
Balão para cultura de células - Flask T300	TPP	Rolamento 90301
equipamento
Pipeta Sorológica Stripettes 5ml	Corning	4487-200EA
Incubadora umidificada Heracells 240	Termocientífico	51026331
Heraeus Multifuge 1S-R	Termocientífico	75004331