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NOTA: Aspirados de medula óssea canina da crista ilíaca foram coletados com o consentimento do dono do cão. Os aspirados de medula óssea canina (aprox. 10 ml) foram anticoagulados pela adição de 15 ml de citrato de sódio a 3,8% imediatamente após a retirada na sala de operações. As amostras foram transferidas para o ambiente laboratorial para processamento no mesmo dia da retirada.
1. Preparação de Uroquinase (Antes do1º Uso)
- Reconstitua a uroquinase usando solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) de acordo com as instruções do fabricante: Adicione 10 ml de PBS ao frasco de entrada do septo usando uma seringa de 10 ml. Dissolver a matéria seca por agitação até obter 50.000 unidades de injecção (U) por ml.
- Preparar alíquotas de 500 μl (25.000 U cada) em tubos estéreis. Armazene alíquotas -20 °C e use-as quando necessário por pelo menos 6 meses.
2. Etapas preparatórias (antes de cada tratamento de medula óssea)
- Descongelar uma alíquota de uroquinase (25.000 U) por aspirado de medula óssea coagulado (volumes aspirados até 25 ml foram tratados com sucesso usando uma única alíquota de 25.000 U).
- Pré-aqueça um banho-maria ou incubadora agitada a 37 °C.
3. Digestão enzimática do coágulo
- Execute todo o trabalho em um gabinete de biossegurança de fluxo laminar para evitar a contaminação microbiana das amostras de medula óssea durante o processamento. Ao trabalhar com material humano potencialmente infeccioso, recomenda-se o uso de luvas de proteção, bem como o manuseio cuidadoso.
- Colocar um filtro de células de 100 μm em cima de um tubo estéril de 50 ml. Despeje cuidadosamente o aspirado de medula óssea através do filtro celular, inclinando o filtro ou movendo o material do coágulo. Use uma ponta de pipeta estéril para melhor fluxo através da malha do filtro.
nota: Evite qualquer diluição do coágulo, por exemplo, lavando o coágulo com PBS. A uroquinase atua indiretamente e requer componentes do soro (ou seja, plasminogênio) da biópsia para uma digestão eficaz. Enquanto continua o procedimento com o material do coágulo, o filtrado pode ser mantido em RT até nova utilização na etapa 3.6.
- Transfira o material do coágulo da medula óssea para uma placa de cultura de células vazia usando uma pinça estéril. Corte os detritos em pequenos pedaços de aproximadamente 2 mm3 usando um bisturi estéril.
- Transfira os pequenos pedaços do coágulo para um tubo de reação de 50 ml usando a pinça estéril. Certifique-se de que o coágulo picado tenha uma aparência úmida. Se parecer seco, use um pouco do filtrado da etapa 3.1 para umedecer.
- Triturar o coágulo pipetando para cima e para baixo por 5 vezes usando uma pipeta de microtitulação de 5 ml. Adicionar 1 alíquota de uroquinase à amostra. Incubar durante 30 min a 37 °C em banho-maria ou numa incubadora agitada (suavemente).
- Triturar pipetando para cima e para baixo por 5 vezes usando uma pipeta de 5 ml. Execute esta etapa em um gabinete de biossegurança. Incubar por mais 30 min a 37°C. Após a incubação, triturar novamente 5 vezes usando uma pipeta de 5 ml. Passar um filtro de células de 100 μm novo para agrupar com o filtrado do passo 3.2.
- Centrifugar a suspensão da célula à temperatura ambiente durante 10 min a 500 x g. Rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em meio conforme descrito abaixo ou de acordo com o procedimento padrão do seu laboratório para cultura de expansão de MSC.
4. Semeadura para Cultura de Células de Expansão e Placas CFU
- Ressuspender as células (constituídas por eritrócitos e células mononucleares) em 50 ml de meio basal: Alfa-MEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina e 2,5 mg/ml de anfotericina B. Contar as células diluídas a 1:10 em solução de Trypan Blue utilizando uma câmara de Neubauer.
- Colocar as células em frascos de cultura de células com uma densidade de 5 x 107 células/cm2 e incubar numa incubadora humidificada a 37 °C. Se disponível, use condições hipóxicas (5% de oxigênio). Para o controlo do ensaio UFC, colocar 109 células numa placa de cultura celular de 10 cm de diâmetro.
- Após 3 dias de cultura, as células-tronco mesenquimais são anexadas à placa de cultura de células enquanto outras células permanecem em suspensão. Troque o meio com meio basal suplementado com 5 ng/ml de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF). Para o controle do ensaio de UFC, trate a placa de cultura de células da mesma forma.
- Continuar a cultura celular durante um total de 2 semanas, trocando meios três vezes por semana. Se as células excederem 80% de confluência, divididas por tripsinização. Para o controle do ensaio CFU, troque a mídia da mesma forma, mas não divida as células ao longo das duas semanas.
5. Diferenciação MSC
- Diferenciação de CTMs caninas
nota: As CTMs caninas foram diferenciadas em linhagens condrogênicas, osteogênicas e adipogênicas por estimulação com o meio apropriado por quatro semanas.
- Diferenciação condrogênica
- Corte de cubos (3 mm de cada lado) de um dispositivo médico em forma de esponja, constituído de colágeno liofilizado tipo I, e utilizado como material de suporte para sustentação das células.
- Semeie MSCs no topo dos cubos na concentração de 4 x 106 células/ml (~70.000 células/cubo).
- Antes da adição do meio, deixe as células aderirem aos cubos por 30 min.
- Manter as construções de colágeno MSC em meio condrogênico consistindo em DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 μg / ml de anfotericina B, 40 ng / ml de dexametasona, 50 μg / ml de ácido ascórbico 2-fosfato, 50 μg / ml de L-prolina, 1x insulina-transferrina-selênio X e 10 ng / ml de fator de crescimento transformador-β1.
- Use a coloração de azul de alcian para visualizar o acúmulo de proteoglicanos nas seções de construtos. Resumidamente, corar as seções O / N com azul de alcian a 0,4% dissolvido em cloridrato de guanidina 0,01% H2SO4 e 0,5M. Em seguida, lave as seções lavadas por 30 min em 40% de DMSO e 0,05M de MgCl2. As células foram contracoradas com vermelho nuclear rápido.