Coloração Sudan IV: Um Procedimento para Coloração de Placas Ateroscleróticas Carregadas de Lipídios no Arco Aórtico de Camundongo Colhido

Resumo

Fonte: Centa, M., et al. Quantificação da aterosclerose em camundongos. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra um procedimento usando a coloração Sudan IV para corar os depósitos de gordura no arco aórtico de camundongo colhido para visualizar as placas ateroscleróticas e determinar a extensão da aterosclerose.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE

1. Análise em face do arco aórtico e da artéria braquiocefálica

1. Prepare leitos de fixação para análise facial dos arcos aórticos. Dobre um segmento de filme de cera de parafina oito vezes para fazer uma superfície plana de 25 mm x 25 mm. Enrole-o com fita isolante elétrica preta para fazer um fundo escuro para a aorta. Coloque uma etiqueta na parte de trás da cama de fixação e use um lápis para escrever o número de identificação do mouse (a tinta normal da caneta desaparecerá no processo de coloração).
2. Transfira o arco aórtico para o leito de fixação e coloque uma gota de PBS em cima dele. Comece a limpar a aorta do tecido adiposo periadventício remanescente sob um microscópio estereoscópico.
   1. Use uma tesoura Vannas e uma pinça Dumont para descascar suavemente todo o tecido adiposo circundante sem manipular ou danificar a aorta. O Sudan IV manchará o tecido adiposo brilhantemente e é crucial remover todo esse tecido neste momento.
      nota: Mantenha a aorta úmida o tempo todo, aplicando PBS adicional quando necessário.
3. Corte a aorta no plano coronal introduzindo a tesoura de Vannas no lúmen aórtico para expor a superfície intimal. Comece a cortar a curvatura externa do arco ascendente na direção distal e continue a abrir os ramos, incluindo a artéria braquiocefálica. Poupe a parte dorsal da região torácica descendente.
   1. Abra a curvatura menor e abra a aorta para exibir a superfície intimal.
      nota: Esta etapa requer habilidades motoras finas e precisa de alguma prática para dominar.
4. Prenda o arco aberto ao leito de fixação usando a extremidade romba dos pinos de insetos minucianos. Use um porta-agulha micro Castroviejo para colocar os pinos no lugar. Dobre suavemente os pinos para longe da amostra quando estiverem no lugar. Prenda a aorta na cama sem esticar a amostra. Armazenar o arco fixado voltado para baixo em uma placa de Petri cheia de PBS a 4 °C.
   nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
5. Prepare uma solução funcional do Sudão IV. Misture 1 g de pó Sudan IV, 100 mL de etanol a 70% e 100 mL de acetona em um frasco escuro e mexa delicadamente por 10 min. Não há necessidade de filtrar a solução e ela pode ser usada por alguns meses se mantida escura em temperatura ambiente. Se a cor da coloração não for satisfatória, uma nova solução pode ser feita e os espécimes corados novamente.
   cuidado: A acetona é um líquido inflamável que pode causar irritação ocular grave. Armazene em local bem ventilado e tome medidas de precaução ao manusear.
6. Organize cinco placas de Petri na bancada do laboratório: uma preenchida com etanol a 70%, uma preenchida com solução de trabalho Sudan IV, duas preenchidas com etanol a 80% e uma preenchida com PBS.
   1. Comece enxaguando a amostra em etanol a 70% por 5 min, colocando o leito de fixação na primeira placa de Petri com o arco voltado para baixo. Transfira a amostra para a solução de trabalho Sudan IV e deixe manchar o arco por 7 min.
   2. Em seguida, enxágue em etanol a 80% por 3 min duas vezes para dester a superfície íntima normal. O tempo de descoloração pode ser ajustado para otimizar os resultados. Por fim, enxágue em PBS antes de colocar a amostra de volta na placa de Petri original.
7. Adquira micrografias usando um estereomicroscópio com ampliação de 10 vezes conectado a uma câmera digital. Tire fotos do arco fixado submerso em PBS usando pequenos pesos de metal (20 mm x 10 mm x 5 mm) para segurar o leito de fixação no fundo de uma placa de Petri.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fita isolante elétrica preta (50 mm de largura)	Qualquer varejista especializado		Para criar leitos de fixação para arcos aórticos.
Tesoura de dissecação (10 cm, reta)	Instrumentos de precisão mundiais	Rolamento 14393	Para dissecção geral de órgãos.
Pinça Dumont #5 (11 cm, reta)	Instrumentos de precisão mundiais	500341	Para microdissecção da aorta.
Etanol 70% (v/v)	Produtos químicos da VWR	83801.29	Líquido e vapor altamente inflamáveis, armazenar em local bem ventilado e manter fresco.
Etanol absoluto ≥99,8%	Produtos químicos da VWR	20821.31	Líquido e vapor altamente inflamáveis, armazenar em local bem ventilado e manter fresco.
Formaldeído 4% estabilizado, tamponado (pH 7,0)	Produtos químicos da VWR	Rolamento 9713.1	Nocivo por inalação, em contacto com a pele e por ingestão.
Isopropanol	Merck	1096341011	Líquido inflamável, causa irritação ocular grave e pode causar sonolência ou tontura.
Porta-agulha Micro Castroviejo (9 cm, reto)	Instrumentos de precisão mundiais	503376	Para fixação de arcos aórticos.
Pinos de insetos Minutien, 0,10 mm	Ferramentas de Belas Ciências	Nº 26002-10	Para fixação de arcos aórticos.
Parafilme M	Bemis	PM992	Filme de cera de parafina usado para criar leitos de fixação para arcos aórticos.
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	-	-	Solução estéril e livre de RNase é necessária para a perfusão de camundongos
Estereomicroscópio	Leica Microsystems	MZ6	Para dissecação e documentação em face
Sudão IV	Sigma-Aldrich	S4261	Não classificado como substância ou mistura perigosa.
Tesoura Vannas (8 cm, reta)	Instrumentos de precisão mundiais	503378	Para microdissecção da aorta.