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1. Incorporação de haste
- Fazer uma solução de agarose a 7% em água (7 g de acarose para eletroforese em 100 ml de água destilada). Dissolva a agarose em autoclave por 20 min ou por micro-ondas por 20 min na intensidade mais baixa (por exemplo, 10% de intensidade de um micro-ondas de 1.250 watts).
- Prepare um molde caseiro para embutir as hastes usando frascos de plástico.
- Usando uma lâmina de barbear, corte o fundo cônico de um tubo de microcentrífuga com tampa de rosca de 2 ml (Parte A). Com uma agulha de seringa, faça um orifício na tampa do tubo ligeiramente maior que o diâmetro da haste a ser embutida. Em seguida, corte 0,5 cm do fundo de um tubo de microcentrífuga de 0,6 ml (Parte B).
- Adicione a porção cortada de 0,5 cm do tubo de microcentrífuga de 0,6 ml no tubo de microcentrífuga pré-cortado de 2 ml. Sele as duas partes usando Parafilme (Figura 1).
NOTA: O fundo do tubo é cortado para facilitar a remoção da amostra incorporada após a solidificação da agarose. O orifício na tampa ajudará a manter a haste firme quando a haste estiver embutida em agarose. O molde servirá para segurar a agarose e manter a haste reta ao incorporar. O Parafilme conterá as duas partes, A e B, até que a agarose esteja firme e a haste seja incorporada.
- Usando uma lâmina de barbear, corte uma seção do caule da área de interesse (por exemplo, no meio do primeiro entrenó do caule).
NOTA: Idealmente, o caule deve ser cortado imediatamente antes de ser incorporado para evitar a destruição por desidratação. Alternativamente, a haste pode ser armazenada temporariamente em uma placa contendo um papel de filtro umedecido com água. Esta placa pode ser colocada no gelo até que esteja pronta para ser embutida para evitar a desidratação e deformação do tecido. Armazenar o caule por períodos superiores a 30 min sem alta umidade fará com que o caule seque.
- Derreta a agarose no micro-ondas em baixa intensidade.
CUIDADO: O frasco que contém agarose pode estar quente. Use uma luva para pegar a garrafa. Deixe a agarose derretida repousar à temperatura ambiente (entre 20 °C e 25 °C) até que esfrie até cerca de 50 °C.
- Pipete lentamente 5 ml de agarose no molde de plástico pré-fabricado para encher o frasco.
NOTA: Certifique-se de que não haja bolhas de ar nos moldes. As bolhas de ar causarão lacunas no molde de agarose e não cobrirão completamente a amostra do caule, o que acabará levando ao corte irregular das seções da amostra.
- Deixe a agarose esfriar por 30 a 60 segundos para se tornar semissólida. Teste com um palito pequeno, certificando-se de que ele possa penetrar e ficar em pé, mas não flutuar, na agarose.
NOTA: Se o caule for colocado quando a agarose ainda estiver quente, danificará a amostra ao enrugar o caule, destruindo a morfologia celular.
- Coloque a haste neste frasco cheio de agarose. Certifique-se de que o caule permaneça reto. Coloque a tampa perfurada de forma que a ponta da haste fique presa pela tampa. Não gire a tampa de rosca. Às vezes, mais de uma haste (de um único tipo) pode ser incorporada em um único frasco; mas, nesse caso específico, não use o cap.
NOTA: Se a tampa de rosca for girada, a haste ficará torcida.
- Deixe o frasco para injetáveis à temperatura ambiente ou a 4 °C durante 10-30 min, até solidificar.
- Remova o molde deslizando-o suavemente para fora do tubo. Abra o Parafilme. Empurre a parte inferior da Parte B do molde suavemente com o polegar para liberar a agarose solidificada da Parte A em uma lâmina de microscópio de vidro.
- Corte o caule embutido em agarose em três pedaços aproximadamente iguais de 1,2 cm de comprimento. Corte a parte do caule que não estava na agarose e descarte-a.
- Conservar estes pedaços de agarose com as hastes embutidas em tubos herméticos de 2 ml para microcentrífuga numa caixa escura a 4 °C até estarem prontos para seccionar. Alternativamente, armazene os tubos a 4 °C por no máximo uma semana.
NOTA: O armazenamento é possível, mas o experimentador precisa estar ciente de que as hastes embutidas ainda estão vivas e, dependendo do experimento, artefatos podem ser introduzidos.
2. Seccionamento da haste
CUIDADO: Leia atentamente o manual do vibratome e siga todas as instruções de segurança.
- Certifique-se de que o disco de amostra esteja limpo e completamente seco (livre de qualquer sólido ou líquido). Limpe o disco de amostra com uma lâmina de barbear para remover qualquer cola residual de experimentos anteriores e lave com água. Em seguida, seque com papel toalha.
NOTA: Isso garantirá que o adesivo funcione bem e se ligue à amostra de agarose. Se esta etapa não for feita corretamente, é possível que a amostra não adira ao disco e, posteriormente, faça com que a amostra caia do disco durante o seccionamento.
- Use lenços de papel macio para remover qualquer umidade do bloco de agarose que contém as amostras.
- Coloque uma pequena gota de adesivo de tecido no disco da amostra. Risque o adesivo para cobrir a área no meio da placa usando a ponta do frasco adesivo. Coloque rapidamente o bloco de agarose de modo que as amostras fiquem perpendiculares ou paralelas à placa para seções transversais transversais ou longitudinais, respectivamente. Deixe o adesivo fixar a amostra ao disco de amostra à temperatura ambiente ou a 4 °C por 10-30 min.
NOTA: Esta é uma etapa sensível ao tempo.
- Fixe o disco de amostra no lugar na bandeja de buffer ou na calha. O(s) bloco(s) de agarose com as seções deve estar em paralelo com a lâmina de barbear. Encha a bandeja tampão com água destilada em temperatura ambiente até que as amostras estejam completamente submersas.
- Corte uma lâmina de barbear ao meio e apare as pontas com uma tesoura resistente para que a lâmina fique completamente plana. Prenda metade da lâmina de barbear pré-cortada no porta-facas.
- Ajuste o ângulo no porta-navalha para 84°, a velocidade para 0.90 mm/s (posição 8 no vibratoma) e a frequência para 50 Hz (posição 5 no vibratoma). Corte seções de 100 μm de espessura. Use o modo contínuo.
NOTA: Esta espessura foi selecionada para garantir que o tecido possa suportar os vários tratamentos ácidos e básicos usados em alguns dos protocolos de coloração. Defina a janela para seccionamento e aguarde 15-20 min em modo contínuo para o vibratomo seccionar um bloco de agarose de aproximadamente 1.2 cm.
- Recolha as secções utilizando uma pipeta de plástico descartável durante o seccionamento no tabuleiro tampão. Alternativamente, as seções podem ser transferidas da bandeja tampão para um copo de vidro e, em seguida, para uma placa de Petri transparente. Transferir algumas seções para os tubos de microcentrífuga de 2,0 ml.
NOTA: As amostras são coletadas de uma placa de Petri porque é mais fácil ver as seções em um fundo claro e porque a bandeja tampão pode ser preparada para a próxima amostra.
- As seções podem ser armazenadas em um tubo de 50 ml ou coletadas e armazenadas em tubos de microcentrífuga de 1,5 a 2 ml a 4 °C por 30 a 60 min.
NOTA: Armazenar as seções por períodos mais longos resultará em baixa qualidade de imagem.
3. Coloração branca de calcofluor
- Dissolva 0,02 g de branqueador fluorescente 28 (calcofluor branco M2R) em 10 ml de água destilada para preparar uma solução de estoque a 0,2%. A solução a 0,2% pode ser armazenada por seis meses em um frasco escuro a 4 °C. Prepare uma solução de trabalho a 0,02% diluindo a solução estoque a 0,2% 10x com água destilada.
- Transfira as seções da haste para um tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Adicione ao tubo 1 ml da solução branca de calcofluor a 0,02%. Pipete suavemente a solução branca de calcofluor a 0,02% para cima e para baixo.
NOTA: Tenha cuidado para não pipetar as seções na ponta da pipeta, pois isso pode danificar as seções.
- Incube em temperatura ambiente por 5 min e repita a pipetagem. Incube a seção por mais 3 min em temperatura ambiente.
NOTA: Deixe as seções assentarem no fundo do tubo para facilitar a pipeta da solução sem danificar as seções.
- Use uma pipeta de 1 ml para retirar 700 μl de solução branca de calcofluor a 0,02% e adicione 700 μl de água destilada; aguarde 5 minutos para enxaguar a solução branca de calcofluor. Repita a lavagem 3-4x. Use uma pipeta de 1 ml com a ponta da pipeta cortada de forma que as seções possam ser pipetadas facilmente sem danos.
- Pipete suavemente as seções na ponta e em uma lâmina de microscópio e cubra-as com uma lamínula. Observe as seções sob luz ultravioleta.
