A Matrigel-Based Assay formação do tubo para avaliar a atividade vasculogênica de células tumorais

Summary

A formação do tubo de ensaio é usado para avaliar a atividade vascular das células tumorais.

Abstract

Ao longo dos últimas décadas, um ensaio de formação do tubo utilizando fator de crescimento reduzida Matrigel foi tipicamente utilizados para demonstrar a atividade angiogênica das células endoteliais vasculares in vitro ^1-5. No entanto, a evidência crescente recentemente demonstrou que este ensaio não se limita a testar o comportamento vascular para as células endoteliais. Em vez disso, ele também tem sido utilizado para testar a capacidade de um número de células tumorais para desenvolver um fenótipo vascular ^6-8. Esta capacidade foi coerente com seu comportamento vasculogênica identificados em animais xenotransplanted, um processo conhecido como mimetismo vasculogênica (VM) ^9. Há uma infinidade de provas que demonstrem que VM mediada por células tumorais desempenha um papel vital no desenvolvimento do tumor, independente de angiogênese da célula endotelial ^{6, 10-13.} Por exemplo, as células tumorais foram encontradas para participar na formação do sangue perfundido canal, vascular em amostras de tecido de melanoma e glioblastoma pacientes ^{8, 10, 11.} Aqui, descrevemos neste ensaio rede tubular como uma ferramenta útil na avaliação da atividade vasculogênica de células tumorais. Descobrimos que algumas linhagens de células tumorais, como o melanoma B16F1 células, as células U87 glioblastoma, e câncer de mama MDA-MB-435 células são capazes de formar túbulos vascular, mas algumas não, como câncer de cólon HCT116 células. Além disso, este fenótipo vascular é dependente número de células banhado no Matrigel. Portanto, este ensaio pode servir como poderoso utilitário para a tela o potencial vascular de uma variedade de tipos de células, incluindo células vasculares, as células tumorais, bem como outras células.

Protocol

1. A Matrigel-Based Assay formação do tubo para avaliar a atividade vasculogênica de células tumorais

1. Preparação de células tumorais e células endoteliais microvasculares: células de tumor cerebral, como U87, células de melanoma B16F1, câncer de mama MDA-MB-435, e as células do cólon HCT116 foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% FBS e penicilina / estreptomicina (todos da Invitrogen ). Células endoteliais microvasculares linhagem humana de células endoteliais (HMVECs) foram cultivados em meio EBM2 (Lonza) suplementado com 1 mg de hidrocortisona / ml e 1 ng / ml fator de crescimento epidérmico, 10% FBS e penicilina / estreptomicina. Células foram lavadas com PBS por três vezes e isolada com 0,05% de tripsina / EDTA (Invitrogen). Após a centrifugação com 2.000 rpm por 5 min, pellets de células foram lavadas novamente com PBS. Então, as células foram contadas peletizadas com um hemocitômetro.
2. Preparação Matrigel: Uma alíquota de fator de crescimento reduzida Matrigel (BD Bioscience) foi aquecido em temperatura ambiente. Antes completamente descongelado, foi transferido para gelo e seu líquido foi mantido no gelo por pelo menos 10 min. Em seguida, 50 ul de Matrigel foi banhado com placas de 96 poços em um nível horizontal que permite a Matrigel para distribuir uniformemente, e incubado por 30 min a 37 ° C.
3. Formação do tubo: Cells (1-2 x 10 ⁴⁾ foram re-suspensos com soro livre de DMEM para células tumorais ou EBM-2 para as células endoteliais, e colocado no topo da Matrigel. Se este ensaio foi utilizado para medir os efeitos de alguns agentes no desenvolvimento dos túbulos, esses agentes (estimuladores ou inibidores) foram adicionados ao meio isento de soro. Cada grupo continha condicional 4-6 poços.
4. Imagem e análise de dados: Após a incubação a 37 ° C durante a noite, cada poço foi analisado diretamente sob um microscópio. Se túbulos eram necessários para a fixação, 100 ul de solução salina 10% baseada em formol foi gentilmente adicionado e dez minutos depois, estava pronto para análise. Sob um microscópio com contraste de fase 10x, túbulos em cada campo foram fotografadas e uma média de túbulos 3-5 campos aleatórios em cada poço foi contado.

2. Resultados representativos:

HMVECs foram utilizados como controle positivo, uma vez que estes túbulos foram desenvolvidos a partir clara corpos celulares alongadas que se unem para formar rede de polígono. Células B16F1, U87 e MDA-MB-435 desenvolvido túbulos vascular semelhantes aos formados por HMVECs, mas HCT116 células não (Figura 1). A formação do tubo celular dose-dependente foi testado em células U87. Como demonstrado na Figura 2, 10.000 células formadas túbulos descontinuado. Quando as células foram dobradas, uma sólida rede vascular foi comparável aos observados em HMVECs. Em contraste, as células menos de 5.000 não conseguiram formar um fenótipo vascular.

Figura 1. Formação do tubo induzida por HMVECs, U87, MDA-MB-435, e B16F1 células, mas não HCT116 células. Todas as células (2 x 10 ⁴⁾ foram carregados em Matrigel e incubados durante a noite. Túbulos foram fotografadas usando contraste de fase. HMVECs foram utilizados como controle positivo. Um representante de 3-5 campos foi mostrado. Bar: 100 mm.

Figura 2. U87 celular induzida por túbulos em um número de células-dependente maneira. Números diferentes de células U87, conforme indicado nos cantos foram usados ​​para a formação do tubo. HMVECs foram usados ​​para um controle positivo. Bar: 100 mm.

Discussion

Para que este ensaio para o sucesso, a qualidade do Matrigel deve ser testada primeiro. Uma pequena amostra pode ser obtido a partir de BD Bioscience de pré-executar o teste usando HMVECs. Produtos de lote diferente pode exibir qualidades diferentes em que alguns lotes não fornecem uma condição ideal para a formação do tubo. Em segundo lugar, as bolhas devem ser evitados quando uma alíquota de Matrigel é carregado em placas de 96 poços, porque as bolhas podem interromper a formação de túbulos. Se pequenas bolhas são encontrados em um poço, o Matrigel pode ser imediatamente voltou para os tubos Matrigel original que deve ser mantido no gelo durante o experimento. Além disso, as células testadas devem ser mantidos em uma taxa de crescimento em uma fase log. Quando todas as condições de cultura, indicando um crescimento lento das células ocorrem, elas devem ser substituídas por células saudáveis. Finalmente, a análise de tubos sob um microscópio deve haver mais de uma hora se os tubos não são fixas porque a temperatura diminuiu (temperatura ambiente) pode afetar a formação do tubo. O ensaio completo deve ser concluído no prazo de 24 horas para evitar a ruptura da estrutura tubular induzida pela morte celular. É bem sabido que a formação do tubo é caracterizada por múltiplos celulares ativados processos, incluindo a migração celular, a adesão célula-célula, sobrevivência e apoptose. Por exemplo, a migração celular e adesão célula-célula são visíveis durante o desenvolvimento do tubo. Após 24 horas, no entanto, a apoptose de células significativa ocorre como rede descontinuado é cada vez mais observado. Esse evento ocorre em ambas as células endoteliais e formação do tubo tumor de células derivadas.

É emergente que este ensaio é fundamental para avaliação da atividade vasculogênica de células tumorais in vitro, o evento que é independente da angiogênese associados a células endoteliais. Aqui, nós mostramos que o melanoma de células linha B16F1 e câncer de mama MDA-line MB-435 desenvolveram redes vascular em Matrigel, consistente com o comportamento vasculogênica destes tipos de tumores em humanos, bem como em modelos animais ^14-17. Embora o fracasso para desenvolver um fenótipo vascular por células em HCT116 Matrigel é mecanicamente desconhecido, especula-se que esta propriedade pode ser vascular tipo de célula do tumor dependente. Seria interessante saber se HCT116 células têm a capacidade de gerar VM in vivo, em comparação com B16F1 e MDA-MB-435 células. Portanto, o estabelecimento deste ensaio é de fundamental importância no estudo da biologia do câncer, biologia vascular bem como a despistagem de drogas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11995
FBS	Invitrogen	16000-044
Growth factor-reduced Matrigel	BD Biosciences	47743-720
EBM2 kit	Lonza Inc.	CC-3156
Nikon ECLIPSE TS100 microscope	Nikon Instruments