Microscopia TIRF para visualizar a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos

1. Lavando as lamínulas

NOTA: Lave as lamínulas (24 mm x 60 mm, #1.5) de acordo com Smith et al., 2013.

1. Arrume as lamínulas em um recipiente de plástico para mala direta.
2. Mergulhe as lamínulas sequencialmente nas seguintes soluções e sonice por 30-60 min, enxaguando com ddH₂O 10 vezes entre cada solução: ddH₂O com uma gota de detergente; 0,1 M KOH. Armazene as lamínulas em etanol 100% por até 6 meses.
   nota: Não toque nas superfícies de vidro com os dedos sem luvas. Em vez disso, use uma pinça.

2. Revestimento de lamínulas limpas (24 mm x 60 mm, #1.5) com mPEG e biotina-PEG-silano

NOTA: Este protocolo usa especificamente um sistema de biotina-estreptavidina para posicionar a actina e os microtúbulos dentro do plano de imagem TIRF. Outros revestimentos e sistemas podem ser usados (por exemplo, anticorpos, poli-L-lisina, NEM miosina, etc.).

1. Descongele alíquotas de pós de PEG-silano e biotina-PEG-silano.
2. Dissolva os pós de PEG em etanol a 80% (pH 2,0) para gerar soluções estoque de revestimento de 10 mg/mL de mPEG-silano e 2-4 mg/mL de biotina-PEG-silano, imediatamente antes do uso.
   nota: Os pós de PEG geralmente parecem dissolvidos, mas podem não estar no nível microscópico. A ressuspensão adequada leva ~ 1-2 min com pipetagem constante. Os usuários são encorajados a pipetar mais 10 vezes após o aparecimento da dissolução do pó.
   cuidado: Use luvas para proteger a pele do HCl concentrado ao fazer etanol a 80% (pH 2,0).
3. Remova a lamínula limpa (24 mm x 60 mm, # 1.5) do armazenamento de etanol usando uma pinça. Seque com gás nitrogênio e guarde em uma placa de Petri limpa.
4. Cobertura de lamínulas com 100 μL de solução de revestimento: mistura de 2 mg/mL de mPEG-silano (MW 2.000) e 0,04 mg/mL de biotina-PEG-silano (MW 3.400) em etanol a 80% (pH 2,0).
   nota: Para revestimento esparso (recomendado), use 2 mg / mL de mPEG-silano e 0,04 mg / mL de biotina-PEG-silano. Para revestimento denso, use 2 mg/mL de mPEG-silano, 4 mg/mL de biotina-PEG-silano.
5. Incubar lamínulas a 70 °C por pelo menos 18 h ou até o uso.
   nota: As lamínulas revestidas degradam-se se forem conservadas a 70 °C durante mais de 2 semanas.

3. Montagem de câmaras de fluxo de imagem

1. Corte 12 tiras de fita dupla face dupla face com um comprimento de 24 mm. Remova um lado do suporte da fita e fixe pedaços de fita adjacentes às seis ranhuras presentes em uma câmara de imagem limpa.
   nota: A fita deve ser plana para uma montagem adequada, caso contrário, as câmaras de imagem vazarão. Remova cuidadosamente o suporte da fita para evitar solavancos. Recomenda-se deslizar as câmaras com fita adesiva em uma superfície limpa para alisar os contatos fita-câmara.
2. Remova o segundo pedaço de fita adesiva para expor o lado adesivo da fita ao longo de cada ranhura da câmara. Coloque a fita da câmara voltada para cima em uma superfície limpa.
3. Misture resina epóxi e soluções de endurecedor 1:1 (ou de acordo com as instruções do fabricante) em um pequeno barco de pesagem.
4. Use uma ponta P1000 para colocar uma gota de epóxi misto entre as tiras de fita no final de cada ranhura da câmara de imagem (seta vermelha; Figura 1A). Coloque a fita da câmara/lado epóxi para cima em uma superfície limpa.
5. Remova uma lamínula revestida da incubadora a 70 °C. Enxágue as superfícies revestidas e não revestidas das lamínulas com ddH₂O seis vezes, seque com gás nitrogênio filtrado e, em seguida, fixe na câmara de imagem com o lado do revestimento da lamínula voltado para a fita.
6. Use uma ponta de pipeta P200 ou P1000 para aplicar pressão na interface fita-vidro para garantir uma boa vedação entre a fita e a lamínula.
   nota: Com uma vedação adequada, a fita dupla-face torna-se translúcida. As câmaras de imagem sem contatos suficientes da câmara de fita vazarão.
7. Incube as câmaras montadas em temperatura ambiente por pelo menos 5 a 10 minutos para permitir que o epóxi sele totalmente os poços da câmara antes do uso. As câmaras de perfusão expiram dentro de 12-18 h após a montagem.
   nota: Dependendo da colocação da fita e da espessura da fita dupla face utilizada, a câmara montada terá um volume final de 20-50 μL.

4. Condicionamento das câmaras de perfusão

1. Use uma bomba de perfusão (taxa definida para 500 μL / min) para trocar sequencialmente as soluções de condicionamento na câmara de perfusão da seguinte forma:
   1. Fluxo de 50 μL de BSA a 1% para preparar a câmara de imagem. Remova o excesso de buffer do reservatório de encaixe Luer-lock.
   2. Fluxo de 50 μL de estreptavidina 0,005 mg/mL. Incube por 1-2 min em temperatura ambiente. Remova o excesso de buffer do reservatório.
   3. Fluxo de 50 μL de 1% de BSA para bloquear a ligação inespecífica. Incubar por 10-30 s. Remova o excesso de buffer do reservatório.
   4. Fluxo 50 μL de tampão TIRF quente (37 °C) 1x (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM de glicose, 0,25% (v/v) metilcelulose (4.000 cp)).
      nota: Não remova o excesso de buffer do reservatório. Isso evita que a câmara seque, o que pode introduzir bolhas de ar no sistema.
   5. Opcional: Fluxo de 50 μL de sementes de microtúbulos estabilizados e 50% biotinilados diluídos em tampão 1x TIRF.
      nota: A diluição adequada deve ser determinada empiricamente e conter a variabilidade de lote para lote. Uma diluição que produz 10-30 sementes por campo de visão funciona bem com essa configuração.

5. Preparação do microscópio

NOTA: As reações bioquímicas contendo filamentos de actina dinâmicos e microtúbulos são visualizadas/realizadas usando um microscópio de fluorescência de reflexão interna total invertida (TIRF) equipado com lasers de estado sólido de 120-150 mW, uma objetiva TIRF de imersão em óleo 63x corrigida por temperatura e uma câmera EMCCD. As proteínas neste exemplo são visualizadas nos seguintes comprimentos de onda: 488 nm (microtúbulos) e 647 nm (actina).

1. Defina o dispositivo aquecedor de platina/objetiva para manter 35-37 °C pelo menos 30 minutos antes da imagem da primeira reação bioquímica.
2. Defina os parâmetros de aquisição de imagem da seguinte maneira:
   1. Defina o intervalo de aquisição a cada 5 s por 15-20 min.
   2. Defina as exposições do laser 488 e 647 para 50-100 ms a 5% -10% da potência. Defina o ângulo TIRF apropriado para o microscópio.
      nota: Independentemente da configuração do microscópio, a maneira mais simples de definir a potência do laser, a exposição e o ângulo TIRF é fazer ajustes nas imagens de qualquer polímero sozinho (consulte 5.2.2.1 e 5.2.2.2, abaixo). Os usuários são fortemente encorajados a usar as configurações de potência e exposição do laser mais baixas que ainda permitem a detecção.
      1. Ajuste a reação de polimerização (Figura 1C) para iniciar a montagem do filamento de actina e adquirir imagens a 647 nm. Faça os ajustes apropriados.
      2. Ajuste a reação de polimerização em um segundo poço de perfusão condicionado para iniciar a montagem dos microtúbulos ( Figura 1C ) e visualize a 488 nm. Faça os ajustes apropriados.

6. Preparação de misturas de reacção proteica

1. Prepare uma solução estoque de tubulina marcada com fluorescência.
   1. Determinar a concentração de tubulina caseira não marcada por espectrofotometria em Abs₂₈₀, do seguinte modo:
      1. Espectrofotômetro em branco com 1xBRB80 sem GTP.
      2. Calcular a concentração de tubulina utilizando o coeficiente de extinção determinado de 115 000 M^‐1 cm^‐1 e a seguinte fórmula:
         
   2. Ressuspenda a 488-tubulina marcada com lisina liofilizada comercialmente fabricada a 10 μM (1 mg / mL; 100% do marcador) com 20 μL de 1x BRB80 sem GTP.
   3. Descongele uma alíquota de 7,2 μL de tubulina reciclada não marcada de 100 μM em gelo.
      nota: A tubulina reciclada é fundamental para a montagem bem-sucedida de microtúbulos in vitro porque remove dímeros incompetentes de polimerização formados em estoques de proteínas congeladas.
   4. Combine 3 μL de 10 μM de 488-tubulina com a alíquota de 7,2 μL de tubulina não marcada de 100 μM, não mais do que 15 minutos antes do uso.
2. Prepare a solução estoque de actina marcada com fluorescência.
   1. Para proteínas caseiras, determine a concentração e a porcentagem de marcação de actina por espectrofotometria AbsAbs₂₉₀ e Abs₆₅₀, da seguinte forma:
      1. Espectrofotómetro em branco com tampão G.
      2. Calcular a concentração de actina não marcada utilizando o coeficiente de extinção determinado de 25,974 M^‐1 cm^‐1 e a seguinte fórmula:
         
      3. Calcule a concentração de lisina marcada com Alexa-647-actina usando o coeficiente de extinção da actina não marcada, o fator de correção de flúor de 0,03 e a seguinte fórmula:
         
      4. Calcule o rótulo percentual de Alexa-647-actina usando o ε determinado para Alexa-647 de 239.000 M^‐1 cm^‐1, da seguinte forma:
         
   2. Descongele uma alíquota de 2 μL de 3 μM de biotina actina 100% marcada (marcada em resíduos de lisina). Diluir 10 vezes adicionando 18 μL de tampão G.
   3. Combine 3 μL de actina biotinilada diluída e volumes apropriados de actina não marcada e rotulada (acima) de modo que a mistura final seja de 12,5 μM de actina total com 10%-30% de marcador fluorescente.
      nota: Mais de 30% por cento de monômeros de actina fluorescentes (final) podem comprometer a resolução da imagem, pois os filamentos se tornam difíceis de discernir do fundo.
3. Preparar misturas de reacção (figura 1C).
   1. Preparar a mistura de citoesqueleto (tubo A) combinando 2 μL do stock de mistura de actina de 12,5 μM (6.2.3) com a mistura de stock de tubulina (6.1.4), não mais do que 15 min antes da obtenção de imagens. Guarde no gelo até o uso.
   2. Prepare a mistura de reação proteica (Tubo B) combinando todos os outros componentes e proteínas experimentais, incluindo 2x tampão TIRF, anti-alvejante, nucleotídeos, tampões e proteínas acessórias. Um exemplo é mostrado na Figura 1C.
      nota: A diluição final resulta em um tampão TIRF 1x que contém ATP, GTP e força iônica dentro da faixa fisiológica estimada.
4. Incubar o tubo A e o tubo B separadamente a 37 °C por 30-60 s. Para iniciar a reação, misture e adicione o conteúdo do Tubo B ao Tubo A (abaixo).

7. Dinâmica da actina e dos microtúbulos da imagem

1. Condicione bem a perfusão (Figura 1B; etapa 4, acima).
2. Inicie a montagem da actina e dos microtúbulos simultaneamente adicionando o conteúdo do Tubo B (mistura de reação) ao Tubo A (mistura de citoesqueleto) (Figura 1C).
3. Fluxo de 50 μL da reação contendo 1x tampão TIRF suplementado com 15 μM de tubulina livre, 1 mM de GTP e 0,5 μM de monômeros de actina e volumes apropriados de controles de tampão.
4. Grave filmes com lapso de tempo usando o software do microscópio para adquirir a cada 5 s por 15-20 min.
   nota: O início da dinâmica da actina e dos microtúbulos ocorre dentro de 2-5 min (Figura 2). Atrasos mais longos indicam problemas com o controle de temperatura ou problemas relacionados à concentração de proteínas na mistura de reação.
5. Condicione um novo poço de perfusão (etapa 4) e substitua o volume do tampão por proteína (s) reguladora (s) de interesse (ou seja, Tau) e controles de tampão (Figura 1C). Adquira conforme descrito na etapa 7 (acima) para avaliar proteínas reguladoras para funções emergentes de microtúbulos de actina.

Figura 1. Esquemas experimentais: montagem da câmara de fluxo para aquisição de imagens. (A) Conjunto da câmara de imagem. De cima para baixo: as câmaras de imagem IBIDI são coladas ao longo dos poços de perfusão (denotados pela seta); a segunda camada (branca) de suporte de fita (deixada na imagem mostrada para orientar melhor os usuários) é removida e o epóxi é aplicado na borda da câmara de perfusão (seta). Nota: Para orientar mais facilmente os usuários sobre onde colocar o epóxi, o suporte branco foi deixado nesta imagem. A lamínula limpa e revestida é fixada à câmara de imagem com o lado do revestimento voltado para o interior do poço de perfusão. (B) Fluxograma ilustrando as etapas para o condicionamento de câmaras de imagem para ligações biotina-estreptavidina. (C) Exemplos de reações usadas para adquirir filmes TIRF de microtúbulos dinâmicos e filamentos de actina.

Figura 2. Sequências de imagens de filamentos de actina e microtúbulos em crescimento na ausência ou presença de Tau. Montagem de imagem em timelapse de ensaios TIRF contendo 0,5 μM de actina (10% de Alexa-647-actina e 0,09% de biotina-actina marcada) e 15 μM de tubulina livre (4% de HiLyte-488 marcado) na ausência (A) ou presença (B) de 250 nM Tau. O tempo decorrido desde o início da reação (mistura do tubo A e do tubo B) é mostrado. Barras de escala, 25 μm.