| 1% BSA (c/v) | Fisher Científico | BP1600-100 | Para este fim (bloqueando as câmaras TIRF), a BSA é ressuspensa em ddH20 e filtrada através de um filtro de 0,22 μm. |
| 1× BRB80 | caseiro | | 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 com KOH |
| 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 com KOH | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | G2133-50KU | Combinado com catalase, alíquota e conservar a -80 oC até à utilização |
| Tubulina de 100 μM | Citoesqueleto Inc, Denver, CO | T240 | As tubulinas caseiras devem ser recicladas antes do uso para remover a tubulina incompetente para polimerização (Hyman et al. (1992)29; Li e Moore (2020)30). As tubulinas disponíveis comercialmente são muitas vezes muito diluídas para reciclar, mas funcionam bem se ressuspensas de acordo com as instruções do fabricante e pré-liberadas por ultracentrifugação (278.000 × g) por 60 min, antes do uso. |
| 100 mM ATP | Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO | A-08 | Ressuspenso em ddH20 (pH 7,5) e esterilizado por filtro. |
| 100 mM GTP | Fisher Científico | AC226250010 | Ressuspenso em 1× BRB80 (pH 6,8) e esterilizado por filtro. |
| Lasers de estado sólido de 120-150 mW | Leica Microsystems | 11889151; 11889148 | |
| 2 mg/mL de catalase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | C40-100 | Combinado com glicose oxidase, alíquota e conservar a -80 oC até à utilização |
| 2× Amortecedor TIRF | Homemad | | 2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM de glicose, 0,5% (v/v) de metilcelulose (4.000 cp); Nota: 1 μL de 0,1M GTP e 1 μL de 0,1M ATP adicionados separadamente às reações TIRF para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. |
| 24 × 60 mm, lamínula #1,5 | Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-266882 | A lamínula deve ser lavada extensivamente antes do uso (Smith et al. (2014)22) |
| Bloco de calor a 37 oC | | | |
| Banho-maria a 37 oC | | | |
| 5 mg/mL de estreptavidina (600x estoque) | Avantor, Filadélfia, Pensilvânia | RLS000-01 | Ressuspensa em Tris-HCl (pH 8,8); diluir a alíquota a 1× em tampão HEK no dia da utilização |
| 5 min Resina epóxi e endurecedor | Loctite, Rocky Hill, CT | 1365736 | A resina combinada e o endurecedor podem levar até 30 minutos para curar. |
| 50% de sementes de microtúbulos biotinilados-GpCpp | Citoesqueleto Inc; Caseiro | T333P | (opcional) As sementes de microtúbulos estabilizadas com GppCpp ou Taxol podem mediar com mais eficiência a polimerização dos microtúbulos. O taxol e o GppCpp estabilizam os microtúbulos de diferentes maneiras que podem afetar a estrutura da rede dos microtúbulos e a capacidade de certas proteínas reguladoras de se ligarem à porção estabilizada do microtúbulo. Um método para fazer diversos tipos de sementes de microtúbulos é descrito em Hyman et al. (1992). |
| Incubadora 70 C | | | |
| Estoque de mistura de actina | Caseiro; este protocolo | | Uma mistura de actina de 12,5 μM composta de actina marcada (fluorescente e biotinilada) e não marcada para até seis reações. 2 μL de estoque são usados na reação final do TIRF. A concentração final de actina usada em cada reação é de 0,5 μM (10% Alexa-647; 0,09% marcado com biotina). |
| Controles de buffer apropriados | caseiro | | Combinação de tampões de todas as proteínas que estão sendo avaliadas |
| Biotina-PEG-silano (MW 3.400) | Laysan Bio Inc | biotina-PEG-SIL-3400 | Dispensado em alíquotas de 2-5 mg, preenchido com nitrogênio, parafilmado fechado e armazenado a -20 C com dessecante até o uso |
| Actina biotinilada | Citoesqueleto Inc; Caseiro | AB07 | A biotina-actina é feita por marcação em resíduos de lisina e, portanto, presume-se que seja pelo menos 100% marcada, mas varia de acordo com os diferentes lotes/preparações. As concentrações óptimas de actina biotinilada devem ser determinadas empiricamente para utilizações/desenhos experimentais específicos. Concentrações mais altas permitem um rastreamento mais eficiente, mas podem impedir a polimerização ou interações com proteínas reguladoras. Aqui, uma pequena porcentagem (0,09% ou 900 pM) de actina biotinilada está presente na reação final do TIRF. |
| Sabão de louça | Amanhecer, Procter e Gamble, Cincinnati, OH | | Por razões desconhecidas, a versão azul limpa as lamínulas com mais eficiência do que outras cores disponíveis. |
| Gelo seco | | | |
| Actina marcada com fluorescência | Citoesqueleto Inc; Caseiro | AR05 | A actina marcada com fluorescência caseira é armazenada em tampão G suplementado com glicerol a 50% a -20 C (Spudich et al. (1971) 47; Liu et al. (2022)48 ). A actina marcada com fluorescência é dialisada contra o tampão G e pré-limpa por ultracentrifugação por 60 min a 278.000 × g antes do uso. |
| Tubulina marcada com fluorescência | Citoesqueleto Inc | TL488M, TLA590M, TL670M | Ressuspenso em 20 μL 1× BRB80 (concentração final de 10 μM) e pré-limpo por ultracentrifugação (278.000 × g) por 60 min, antes do uso. |
| Amortecedor G | caseiro | | 3 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM DTT, 0,2 mM ATP |
| Buffer HEK | caseiro | | 20 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA (pH 8,0), 50 mM KCl |
| gelo | | | |
| Balde de gelo | | | |
| Câmara de imagem | IBIDI, Fitchburg, WI | Rolamento 80666 | Encomende câmaras sem fundo para utilizar diferentes revestimentos de lamínula |
| Câmera iXon Life 897 EMCCD | Andor, Belfast, Irlanda do Norte | 8114137 | |
| Software de microscópio LASX Premium | Leica Microsystems | 8114137 | |
| Metilcelulose (4.000 cp) | Sigma Aldrich Inc | M0512 | |
| Base do microscópio equipada com módulo TIRF | Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha | 11889146 | |
| mPEG-silano (MW 2.000) | | | |
