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1. Conduzindo o Alinhamento Diário do LLSM
NOTA: (Importante) Este protocolo de alinhamento é baseado no instrumento LLSM usado (consulte a Tabela de Materiais). Cada LLSM pode ser diferente e exigir diferentes estratégias de alinhamento, especialmente aquelas que são construídas em casa. Realize o alinhamento de rotina apropriado e continue na seção 2.
- Adicione 10 mL de água mais 30 μL de fluoresceína (estoque de 1 mg/mL) ao banho LLSM (volume de ~ 10 mL), pressione Imagem (Início) para mover a objetiva para a posição da imagem e observe um único padrão de feixe de laser Bessel. Alinhe o feixe de laser usando as guias e a região de interesse (ROI) predefinida para tornar o feixe um padrão fino equilibrado em todas as direções.
- O feixe também deve aparecer focado na câmera localizadora. Use dois ajustadores de inclinação do espelho, um micrômetro superior, foco e um colar de objetiva de emissão para ajustar. Consulte a Figura 1, A e B para a viga alinhada corretamente.
- Lave o banho e as objetivas com pelo menos 200 mL de água para remover completamente a fluoresceína.
- Grânulos fluorescentes padrão de imagem nos meios de imagem (preparados aderindo grânulos a uma lamínula de 5 mm com poli-L-lisina, consulte a Tabela de Materiais; isso pode ser pré-preparado e reutilizado) para a função de propagação de ponto físico (PSF) em meios de imagem.
NOTA: Só pode haver uma conta à vista para processamento posterior, então tente encontrar uma conta que esteja sozinha no visualizador ou que possa ser facilmente cortada para obter uma única conta.
- Ative o pontilhamento definindo-o como 3 na caixa 'X Galvo range'. Pressione Ao vivo para visualizar o campo atual. Mova-se ao longo da direção Z para encontrar a lamínula e as miçangas. Encontre o centro de uma conta movendo-se ao longo de Z, pressione Parar para pausar o laser. Verifique 3D, pressione Centro e, em seguida, pressione Executar. Isso coletará os dados.
- Ajuste manualmente o espelho de inclinação, o colar da objetiva e o micrômetro de foco para obter os valores de cinza mais altos e, em seguida, ajuste conforme necessário para obter os padrões adequados para os modos de captura de varredura objetiva, z galvo, z+objective (totPSF) e varredura de amostra (samplePSF). Veja a Figura 1 CF para projeções de intensidade máxima (MIPs) devidamente ajustadas).
nota: Os vários modos de captura (varredura objetiva, z galvo, z+objective e varredura de amostra) alteram a forma como a folha de luz se move pela amostra. Todos os modos de varredura devem ser usados para alinhamento.
- A verificação de amostra mostra como os dados serão coletados durante o experimento. Colete o PSF de amostra pressionando Executar no modo de varredura de amostra para desinclinação e deconvolução. Altere os lasers para três modos de cores (488, 560, 647) e pressione Executar novamente.
nota: Como as imagens LLSM estão em um ângulo (57,2°), as imagens capturadas no modo "varredura de amostra" são coletadas nesse ângulo e, portanto, são "distorcidas". A desinclinação é o processo de correção desse ângulo e "realinhamento" da imagem para uma verdadeira pilha z. Esses dados devem ser coletados em meios de imagem e em todos os canais que serão fotografados durante o experimento. Se isso não for coletado corretamente, os dados não serão desdistorcidos adequadamente. Da mesma forma, certifique-se de que o meio foi aquecido a 37 °C (ou temperatura experimental desejada).
2. Configurando células com LLSM
- Adicione 100.000 células apresentadoras de antígenos (APCs) (50 μL) a uma lamínula circular de 5 mm de diâmetro e deixe-as repousar por 10 min.
- Lubrifique o porta-amostras e adicione a lamínula com a célula voltada para cima. Adicione uma gota de mídia de imagem na parte de trás da lamínula para evitar bolhas antes de colocá-la no banho. Aparafuse o sample suporte no piezo e pressione Imagem (Home).
- Encontre um APC para criar imagens para garantir que o LLSM e o software de imagem (consulte Tabela de materiais) estejam funcionando corretamente.
nota: Criamos imagens em tamanho de passo de 0,4 μm com 60 passos z e exposição de 10 ms para duas cores com um pontilhamento definido como 3, o que resulta em 1,54 s por quadro da imagem 3D com resolução de ~ 200 nm XY e 400 nm Z. Essas configurações podem precisar ser ajustadas com base no tamanho da célula, resolução z desejada e intensidade do sinal da técnica de marcação fluorescente usada. O uso da potência do laser também varia de acordo com a técnica de rotulagem fluorescente usada.
- Pressione Ao vivo para view a imagem atual. Mova-se ao longo de Z para encontrar a lamínula e as células.
- Encontre o centro de um APC movendo-se na direção Z e pressione Parar para pausar o laser. Verifique 3D e insira as configurações desejadas, pressione Centro e, em seguida, pressione Executar. Isso coletará os dados.
- Abaixe a platina para a posição de carga e adicione 50 μL de células T em meios de imagem (100.000 células) gota a gota diretamente sobre a lamínula. É melhor deixar uma gota se formar na extremidade da ponta da pipeta e, em seguida, tocar a ponta no líquido do banho. Levante o palco para trás clicando em "Imagem (Retornar)".
- Comece a criar imagens. Certifique-se de definir o tamanho da pilha desejado e o comprimento do lapso de tempo. Por exemplo, crie uma imagem de 60 pilhas z em um tamanho de passo de 0,4 μm e insira 500 quadros de tempo. (Normalmente) pare a gravação antes de atingir 500 quadros para evitar o fotobranqueamento. Use o modo Live para procurar pares de células e, quando as configurações prontas e desejadas forem inseridas, pressione Executar para coletar dados. Consulte a Figura 2 para obter um exemplo.
