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1. Preparação da lâmina do microscópio
NOTA: Células U87 MG da terceira à décima geração com alta atividade são usadas em experimentos SPT.
- Esterilizar lamínulas de 22 mm × 22 mm já limpas com solução de Piranha por imersão em etanol (99,9%).
- Use uma pinça para retirar a lamínula da solução de etanol (etapa 1.1) e esterilize queimando etanol na chama. Depois que todo o etanol estiver queimado, coloque as lamínulas em uma placa de cultura de células de plástico (35 x 10 mm) cheia de 2 mL de meio celular (sem vermelho de fenol).
- Adicione 50 μL da suspensão celular na lamínula e empurre suavemente o prato para frente e para trás e para a esquerda e para a direita para distribuir uniformemente as células. Coloque-o em uma atmosfera umidificada.
- Quando as células U87 MG na lamínula atingirem 20% a 40% de confluência (~ 12 h), adicione 20 μL de CTAB-AuNRs (nanobastões de ouro sintetizados com molécula de brometo de amônio e cetiltrimetilamônio como agente protetor, 138 pM) no prato e disperse. Incubar em atmosfera umidificada por 5 min.
- Adicionar 100 μL do meio de cultura (sem vermelho de fenol) da placa no passo 1.4 na ranhura da lâmina de vidro ranhurada (Figura 1) que é pré-limpa com solução de Piranha.
- Retire a lamínula do prato e inverta-a na parte superior da ranhura da lâmina de vidro do microscópio (Figura 1). Sele-o com esmalte, deixe secar e coloque-o no palco para realizar experimentos SPT.
2. Realização de experimentos de rastreamento de partícula única com microscopia de campo escuro (Figura 1).
- Coloque uma gota de óleo no condensador de campo escuro imerso em óleo (abertura numérica (NA) 1.43-1.20) e gire o botão para fazer o condensador entrar em contato com a corrediça de vidro.
- Coloque uma gota de óleo na parte superior da lamínula e gire o botão de foco para fazer a objetiva de imersão em óleo de 60x (NA 0.7–1.25) tocar no óleo.
- Ligue a fonte de luz e gire levemente o botão de foco para focar o plano de imagem.
nota: No campo de visão, o fundo é preto, as células são brilhantes e os CTAB-AuNRs (proporção ~ 2: 1, Figura 2) são pequenos pontos de dispersão coloridos (vermelho, amarelo ou verde).
- Capture a luz de dispersão de amostras por uma câmera CMOS colorida. Clique no "ícone da câmera" no software para gravar e exportar o formato TIFF para salvar imagens.
3. Aquisição de dados
- Extraia uma única trajetória de longo prazo
- Opere conforme descrito na Figura 3 para converter as imagens de campo escuro da série temporal do modo "cor RGB" para o modo "8 bits". Na imagem J, clique em Imagem | Tipo | 8 bits. Para ajustar o contraste, clique em Imagem | Ajustar | Brilho | Contraste.
- Selecione uma partícula alvo e corte os planos de fundo da série temporal encaixotando e excluindo o plano de fundo com "Ctrl+X".
- Abra a janela de detecção e vinculação de partículas clicando no botão "Plugins | Rastreador de Partículas Clássico | Rastreador de partículas".
- Defina Radius como 6, Cutoff como 0 e Percentil como 0,01%.
nota: Para detectar a partícula, ajuste os três parâmetros acima com a ajuda da visualização. Certifique-se de que o raio seja ligeiramente maior que a partícula alvo e menor que a menor separação entre partículas. Percentil é o limite inferior da distribuição de intensidade que devem ser partículas candidatas.
- Defina o intervalo de links como 5 e o deslocamento como 10.
nota: Para vincular a partícula entre quadros adjacentes consecutivos, ajuste os dois parâmetros acima. Deslocamento é o máximo de pixels que uma partícula pode mover entre dois quadros sucessivos, e Intervalo de vínculos é o número de quadros consecutivos a serem considerados ao determinar a melhor correspondência correspondente.
- Clique em "OK" para abrir a janela Resultados do ParticleTracker para ver os resultados.
- Clique em "Visualizar todas as trajetórias" para inspecionar as trajetórias geradas.
- Clique no menu "Revincular partículas" na parte superior para vincular novamente as partículas detectadas com diferentes intervalos de links e parâmetros percentuais, se a trajetória gerada pelo software não corresponder à trajetória em movimento do AuNR.
- Clique em "Salvar relatório completo" para salvar os resultados se a trajetória gerada pelo software e a trajetória móvel do AuNR forem correspondidas.
NOTA: Um exemplo de extração de uma única trajetória de longo prazo com a Imagem J é mostrado na Figura 4.
