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1. Modificação do microscópio e lente objetiva
- Insira um espelho 50/50 na roda do filtro do microscópio fluorescente usando um cubo de filtro apropriado (Figura 1). Manuseie o espelho 50/50 com cuidado, pois sempre eles têm revestimento antirreflexo.
nota: Usamos um espelho 50/50 em um cubo de filtro vazio do microscópio. O espelho 50/50 é inserido onde o espelho dicróico está localizado.
- Use uma objetiva de óleo de alta ampliação/alta abertura numérica (NA).
nota: Neste protocolo, usamos uma objetiva de 100x/1,3 NA.
2. Preparação da câmara para aderir os microtúbulos à superfície
- Limpe as lâminas do microscópio e as lamínulas de 22 mm x 22 mm (para microscópio vertical) ou as lamínulas de 22 mm x 22 mm e 18 mm x 18 mm (para microscópios invertidos). Modifique a superfície conforme necessário. Por exemplo, limpe as lamínulas usando um detergente alcalino (consulte a Tabela de Materiais) seguido de etanol 100% com lavagens com água destilada entre e depois.
- Corte tiras de filme plástico de parafina de 3 mm de largura (consulte a Tabela de Materiais) usando uma lâmina de barbear e outra lâmina de microscópio como borda.
- Coloque duas tiras de filme plástico de parafina separadas por 3 mm em uma lamínula limpa de 22 x 22 mm. Em seguida, coloque uma lamínula de 18 mm x 18 mm para formar um canal. Se estiver usando um microscópio vertical, coloque as tiras em cima de uma lâmina de microscópio limpa e, em seguida, coloque uma lamínula em cima.
- Coloque a lamínula (ou lâmina) em um bloco de calor a 100 ° C por 10-30 s para que o filme de parafina forme um canal selado.
- Fluxo em 50 μg / mL de anticorpo (em Brinkley Buffer 1980 (BRB80)) por perfusão usando uma pipeta. Incubar por 10 min.
nota: Usamos anticorpos anti-rodamina para ligar sementes de microtúbulos marcados com rodamina à superfície. Alternativamente, a avidina pode ser usada para ligar sementes de microtúbulos marcados com biotina ou a partículas de ouro biotiniladas. Para simplesmente observar os microtúbulos na ausência de tubulina em solução (ou seja, um ensaio não dinâmico), um anticorpo anti-tubulina pode ser usado.
- Lave cinco vezes com tampão BRB80. Recomenda-se filtrar as soluções usando um filtro de 0,22 μm.
- Fluxo em 1% de poloxâmero 407 (um copolímero tribloco) em BRB80 para bloquear a superfície contra a ligação não específica. Incubar por 10 min.
- Lave cinco vezes com tampão BRB80.
- A amostra está pronta para ser colocada no microscópio. Para evitar que a amostra seque, adicione duas gotículas de tampão BRB80 nas extremidades do canal e reabasteça quando necessário.
3. Alinhamento do microscópio
- Coloque a amostra no microscópio stage. Ligue a fonte de luz de epi-iluminação.
- Concentre-se na superfície da amostra. Você observará várias superfícies à medida que a objetiva é movida para cima e para baixo devido ao reflexo traseiro da luz da óptica dentro do caminho óptico. Um bom método para encontrar a superfície da amostra é focar na borda do filme de parafina. Assim que a superfície for encontrada, defina o campo de view para o centro da câmara.
- Centralize o diafragma de campo no campo de viewfechando-o até a metade e usando os parafusos de ajuste. Uma vez alinhado, reabra o diafragma.
nota: O ajuste do parafuso só precisa ser feito esporadicamente, talvez a cada 3-6 meses ou na solução de problemas.
- Deslize a lente Bertrand para view a pupila de saída (plano focal traseiro) da objetiva.
- Feche o diafragma de abertura (AD) além das bordas da pupila de saída da objetiva.
- Use os parafusos de ajuste para centralizar o AD com a pupila de saída. Verifique novamente abrindo o AD e combinando suas bordas com as da pupila de saída.
nota: Esse ajuste só precisa ser feito esporadicamente.
- Defina o diafragma de abertura para cerca de 2/3 do NA da objetiva.
4. Imagem de microtúbulos estabilizados ou partículas de ouro de 40 nm
NOTA: Microtúbulos estabilizados e nanopartículas de ouro servem como boas amostras de controle. Recomenda-se obter imagens de microtúbulos ligados à superfície ou nanopartículas de ouro como primeiro passo para avaliar o desempenho do IRM e ajudar a definir a abertura ideal do diafragma de abertura (seção 7).
- Defina o tempo de exposição da câmera para 10 ms e ajuste a iluminação para quase saturar a faixa dinâmica da câmera.
- Fluxo em 10 μL de microtúbulos estabilizados com guanilil-(alfa, beta)-metileno-difosfonato (GMPCCP) ou taxol em BRB80 (ou partículas de ouro de 40 nm) por perfusão usando uma pipeta para uma amostra fresca e monitore a ligação por imagem da superfície. Uma vez que 10-20 microtúbulos estejam ligados dentro do campo de view, lave a amostra 2x com BRB80.
nota: Com um microscópio bem alinhado, os microtúbulos devem ser visíveis sem subtração de fundo.
- Adquira 10 imagens definindo um lapso de tempo com período de atraso de 1 segundo por 10 segundos (com exposição de 10 ms).
- Adquira uma imagem de fundo. Para fazer isso, mova o palco usando o controlador de palco ou software de computador ao longo do eixo do canal enquanto adquire 100 imagens sem atraso (ou seja, streaming próximo a 100 fps @ 10 ms de exposição).
nota: O fundo é a mediana das 100 imagens. Ao tomar a mediana, o perfil de iluminação e outras características estacionárias, como sujeira na ótica, são preservadas enquanto todo o resto é filtrado. Não deve haver inclinação na amostra, pois isso levará a uma mudança na posição axial à medida que o estágio é movido e, por fim, degradará a imagem de fundo. Se a inclinação não puder ser evitada, um método alternativo é adquirir imagens de fundo médias antes de fluir as sementes.
- Para processar e analisar as imagens, vá para a etapa 6.
5. Imagem da dinâmica dos microtúbulos
- Para a dinâmica dos microtúbulos usando tubulina cerebral, ajuste a temperatura do aquecedor de amostra para 37 °C.
- Fluxo em 10 μL de sementes de microtúbulos estabilizadas com GMPCCP em BRB80 por perfusão usando uma pipeta para uma amostra fresca e monitore-as ligando-as à superfície por meio de imagens da superfície ao vivo (ou seja, durante o fluxo). Uma vez que 10-20 sementes estejam ligadas ao campo de visão, lave a amostra usando 2x o volume do canal com BRB80 (o BRB80 deve ser pré-aquecido a 37 °C ou pelo menos à temperatura ambiente).
nota: Com um microscópio bem alinhado, as sementes devem ser visíveis sem subtração de fundo.
- Fluxo na mistura de polimerização (7,5 μM de tubulina não marcada + 1 mM de trifosfato de guanosina (GTP) + 1 mM de ditiotreitol (DTT) em tampão BRB80). Para medir o crescimento dos microtúbulos, defina um lapso de tempo usando o software de aquisição para adquirir uma imagem a cada 5 segundos (0.2 quadros por segundo (fps)) por 15 minutos.
- Para aumentar o contraste, adquira 10 imagens (em vez de uma) em cada ponto de tempo e calcule a média. Para encolhimento de microtúbulos, adquira imagens a 100 fps definindo o atraso de tempo para 0 e um tempo de exposição de 10 ms (fps mais altos são possíveis com regiões de interesse menores, dependendo da câmera usada).
- Adquira uma imagem de fundo como na etapa 4.4.
6. Processamento e análise de imagens
NOTA: Para análise, este protocolo usa Fiji, mas o leitor é livre para usar qualquer software que achar adequado.
- Abra as imagens de fundo salvas.
- Calcule a imagem mediana (ou seja, plano de fundo) usando a pilha de > de imagem > projeto Z > mediana.
- Abra o filme de dinâmica de microtúbulos como uma pilha (o mesmo para microtúbulos não dinâmicos) usando Arquivo > Abrir.
- Subtraia a imagem de fundo da pilha usando a calculadora de Processo > Imagem. Certifique-se de marcar a opção "resultado de 32 bits (flutuante)".
- Para microtúbulos dinâmicos, usando a ferramenta de linha, desenhe uma linha ao longo do microtúbulo de interesse e adicione-a ao gerenciador de região de interesse pressionando "t". Repita para todos os microtúbulos de interesse.
- Para microtúbulos dinâmicos, execute a macro Multi-Kymo. A macro irá gerar um vídeo e um quimógrafo para cada microtúbulo no gerenciador de ROI. Cada microtúbulo receberá um identificador exclusivo.
- Para microtúbulos dinâmicos, execute a macro Kymo-Analysis e siga suas etapas para medir as taxas de crescimento e encolhimento dos microtúbulos.
7. Tamanho do diafragma de abertura
NOTA: Um fator importante para adquirir imagens de alto contraste de microtúbulos usando IRM é definir a abertura numérica de iluminação (INA) corretamente. O INA pode ser alterado alterando o tamanho do feixe de iluminação de entrada na pupila de saída da objetiva, que é controlada pelo tamanho do AD (o AD está localizado em um plano conjugado com a pupila de saída (plano focal traseiro) da objetiva, Figura 1):
onde DAD é o diâmetro do diafragma de abertura, fobjective é a distância focal da objetiva e Dep é o diâmetro da pupila de saída da objetiva. Normalmente, o AD é deixado totalmente aberto para imagens de fluorescência, de modo que o INA é igual ao NA da objetiva. Em um microscópio de fluorescência, a escala AD não indica seu diâmetro, portanto, o INA não pode ser calculado. É possível calibrar o tamanho do AD com a ajuda de uma objetiva. No entanto, não é necessário, pois o tamanho do AD seria fixado no tamanho que produz o maior contraste.
- Prepare uma amostra de microtúbulos estabilizados marcados com fluorescência presos à superfície (etapas 4.1-4.2).
nota: Foram utilizados microtúbulos marcados com tetrametilrodamina (Ex: 550 nm, Em: 580 nm).
- Traga os microtúbulos em foco usando o botão de foco do microscópio enquanto os fotografa com fluorescência (se os microtúbulos não estiverem marcados, visualize-os com IRM ou DIC).
- Defina a exposição da câmera para 10 ms usando o software da câmera.
nota: Essa exposição é arbitrária e uma exposição de 100 ms também funcionaria.
- Feche o AD até sua menor abertura. Ajuste a iluminação para quase saturar a faixa dinâmica da câmera ou para o máximo possível.
nota: Como guia, use a tabela de pesquisa normalmente fornecida pelo software de aquisição.
- Adquira 10 imagens (transmitindo ou tirando uma imagem a cada segundo) de um campo de visão contendo 10+ microtúbulos.
- Adquira uma imagem de fundo como na etapa 4.4.
- Altere o tamanho do AD e repita as etapas 7.5-7.6 para toda a faixa de abertura do AD (de fechado para o tamanho da pupila de saída, Figura 2). Sempre que o tamanho do AD for alterado, ajuste a intensidade da iluminação para corresponder à do passo 7.4.
- Para cada campo de visão adquirido, subtraia o fundo correspondente usando a calculadora de imagens > processo e escolhendo "subtrair" no menu suspenso. Certifique-se de que a opção "resultado de 32 bits (flutuante)" esteja marcada. Em seguida, calcule a média das imagens resultantes usando a pilha de imagens > > Z projeta> média.
- Meça a relação sinal-ruído de fundo (SBR) dos microtúbulos, definida como a intensidade média do sinal dos microtúbulos (intensidade do microtúbulo menos a intensidade do fundo) dividida pelo desvio padrão do fundo (figura 3).
- Determine o tamanho ideal do AD (ou seja, INA ideal) calculando o SBR médio dos microtúbulos para cada tamanho de abertura e defina o tamanho do AD para aquele que produz o SBR mais alto (Figura 2). É possível que haja uma variedade de tamanhos de AD que produzam contraste comparável.
