Microscopia de reflexão de interferência para visualização sem rótulos da dinâmica dos microtúbulos

Abstract

Fonte: Mahamdeh, M., et al. Implementação de Microscopia de Reflexão de Interferência para Imagem de Microtúbulos de Alta Velocidade e Sem Marcadores. J. Vis. Exp. (2019).

Neste vídeo, descrevemos a técnica de microscopia de reflexão de interferência (IRM) para visualizar microtúbulos crescendo em uma superfície de lamínula na presença de um tampão adequado. Após a iluminação com luz incidente, a interface capulínula-buffer e a interface tampão-microtúbulo refletem a luz, que se combina para criar um padrão de interferência, permitindo a visualização de microtúbulos como imagens de alto contraste contra um fundo brilhante.

Protocol

1. Modificação do microscópio e lente objetiva

1. Insira um espelho 50/50 na roda do filtro do microscópio fluorescente usando um cubo de filtro apropriado (Figura 1). Manuseie o espelho 50/50 com cuidado, pois sempre eles têm revestimento antirreflexo.
   nota: Usamos um espelho 50/50 em um cubo de filtro vazio do microscópio. O espelho 50/50 é inserido onde o espelho dicróico está localizado.
2. Use uma objetiva de óleo de alta ampliação/alta abertura numérica (NA).
   nota: Neste protocolo, usamos uma objetiva de 100x/1,3 NA.

2. Preparaçã....

Results

Figura 1. Representação esquemática do IRM. (A) A epi-iluminação da fonte de luz passa pelo diafragma de abertura antes de atingir o espelho 50/50. O diafragma de abertura define a largura do feixe, portanto, a iluminação NA. O espelho 50/50 reflete parcialmente a luz até a objetiva para iluminar a amostra. A luz refletida da amostra é coletada e depois projetada no chip da câmera (pela lente do tubo), onde interfere para gerar a im.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
microscópio	Nikon	Ti-Eclipse	Um microscópio invertido usado para realizar os acabamentos
Divisor de feixe 50/50	Chroma	21000	Ao comprar, certifique-se de escolher as dimensões do divisor que se encaixam no cubo usado no microscópio
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Objetiva de íris	Nikon	MRH02902	Objetivo de imagem. Esta objetiva tem uma íris de ajuste de NA que foi aberta para NA 1.3
Detergente universal Mucasol	Sigma-Aldrich	Z637181-2L	Usado para limpar lamínulas e lâminas
Filme plástico de parafina (nome comercial Parafilm M)	Sigma-Aldrich	Pág. 7793	Usado para a construção de canais de fluxo
Anticorpo anti-TAMRA	Invitrogen	A-6397	Usado para ligar moléculas marcadas com TAMRA (por exemplo, microtúbulos) à superfície da amostra. RRID (AB_2536196)
Poloxamer 407 (nome comercial Pluronic F-127)	Sigma-Aldrich		Usado para bloquear a superfície do canal para evitar ligações não específicas
nanopartículas de ouro de 40 nm	Sigma-Aldrich	753637	Usado como amostra de controle
nanopartículas de ouro de 20 nm	Sigma-Aldrich	Rolamento 753610	Usado como amostra de controle
Câmera Zyla 4.2	Andor	Zyla 4.2	2048x2048 pixles (tamanho de pixel de 6,5 μm) com eficiência quântica de 72% e faixa dinâmica de 16 bits
Software de rastreamento Feista			https://www.bcube-dresden.de/ fiesta/wiki/FIESTA
Microtúbulos estabilizados			Preparado em casa (ver referências no texto)