Microscopia de Força Atômica Estática para Visualizar e Caracterizar Nucleossomos Montados

Abstract

Fonte: Stormberg, T., et al. Sondando a estrutura e a dinâmica dos nucleossomos usando imagens de microscopia de força atômica. J. Vis. Exp.(2019)

Neste vídeo, demonstramos a microscopia de força atômica estática para visualizar nucleossomos montados. Esta técnica de imagem de alta resolução permite o estudo da estrutura do nucleossomo.

Protocol

1. Funcionalização da superfície da mica para imagens estáticas de nucleossomos AFM

1. Prepare uma solução-mãe de 1-(3-aminopropil) silatrana APS a 50 mM em água deionizada, conforme descrito. Armazenar alíquotas de 1 mL desta solução a 4 °C até o uso.
   nota: As alíquotas podem ser armazenadas durante mais de um ano a 4 °C.
2. Prepare uma solução APS 1:300 funcional para modificação de mica, dissolvendo 50 μL do estoque APS de 50 mM em 15 mL dd H₂O.
   nota: Esta solução de trabalho pode ser armazenada em temperatura ambiente por vários dias.
3. Corte tiras de mica de 1 x 3 cm de folhas de mica de alta qualidade (consulte a Tabela de Materiais para mica usada aqui).
   1. Verifique se a peça se encaixa quando colocada diagonalmente em uma cubeta. Use a ponta de uma pinça afiada, uma lâmina de barbear ou fita adesiva para cortar as camadas da mica até que ambos os lados estejam recém-clivados e a peça fique fina quanto ~ 0,1 mm (Figura 1A). Coloque imediatamente o pedaço de mica na cubeta cheia de APS e incube por 30 min (Figura 1B).
4. Transfira o pedaço de mica para uma cubeta cheia de dd H2O e deixe de molho por 30 s (Figura 1C). Seque completamente ambos os lados da tira APS-mica sob um fluxo de argônio.
   nota: Um lenço umedecido de sala limpa de celulose e poliéster não tecido (limpeza recomendada detalhada nos materiais) pode ser usado para ajudar a absorver a água da borda da mica durante a secagem.
5. Use a tira de mica seca agora para a preparação da amostra. Caso contrário, guarde a peça em uma cubeta limpa e seca (Figura 1D).
   nota: Recomenda-se armazenamento adicional no vácuo por 1-2 h quando o ambiente estiver úmido. O protocolo pode ser pausado aqui.

2. Preparação de amostras de nucleossomos em APS-Mica para imagens estáticas de AFM

1. Aplique fita adesiva dupla face em vários discos magnéticos e coloque-os de lado.
2. Corte o substrato APS-mica no tamanho desejado (quadrados de 1 x 1 cm para o instrumento MM AFM usado aqui). Coloque essas peças em uma placa de Petri limpa e mantenha-as cobertas.
3. Prepare três diluições dos nucleossomos montados (concentrações finais de nucleossomos de 0,5, 1,0 e 2,0 nM) usando um tampão filtrado de 0,22 μm contendo 10 mM HEPES pH 7,5 e 4 mM MgCl₂,
   nota: Para limitar a perda de nucleossomos na baixa concentração final, as diluições devem ser feitas uma de cada vez, imediatamente antes da deposição na APS-mica.
4. Deposite 5-10 μL da amostra de nucleossomo diluída no centro da peça APS-mica e deixe incubar por dois minutos. Enxágue suavemente a amostra com 2-3 mL de dd H₂O para remover todos os componentes do tampão. Depois que cada ~0,5 mL de dd H₂O for usado, agite suavemente a mica para remover o excesso de água de enxágue.
   nota: Uma seringa descartável é recomendada para esta etapa de enxágue.
5. Seque a amostra depositada sob um leve fluxo de gás argônio limpo.
   nota: A amostra agora está pronta para ser fotografada ou pode ser armazenada em um gabinete de vácuo ou dessecador cheio de argônio. As amostras preparadas e armazenadas conforme descrito foram fotografadas um ano após a preparação, sem perda de qualidade. O protocolo pode ser pausado aqui.

3. Imagem estática do AFM dos nucleossomos

1. Monte uma ponta AFM no suporte da ponta. Use uma ponta que tenha uma constante de mola de ~40 N/m e uma frequência de ressonância entre 300 e 340 kHz (consulte a Tabela de Materiais para os cantilevers usados aqui).
2. Monte a amostra preparada na seção 3 no estágio AFM, tomando cuidado para não entrar em contato com a superfície da amostra.
3. Posicione o laser sobre o cantilever até que a soma esteja no máximo e ajuste os valores de deflexão vertical e lateral para perto de zero.
4. Ajuste a ponta de prova do AFM para encontrar sua freqüência da ressonância e ajuste a amplitude da movimentação e ajuste o tamanho da imagem a 100 x 100 nanômetro. Clique no botão de engate para iniciar a aproximação.
5. Uma vez abordado, otimize gradualmente o ponto de ajuste de amplitude até que a superfície da amostra seja claramente vista. Aumente o tamanho da digitalização para 1 x 1 μm e a resolução para 512 x 512 pixels. Clique no botão de captura seguido do botão de engajamento para iniciar a aquisição da imagem.
   nota: As imagens na Figura 2 mostram o fundo liso que pode ser esperado ao obter imagens dessas amostras.

Results

Figura 1: Esquema do processo para preparar a mica funcionalizada APS para a imagem latente do AFM dos nucleossomos. (A) uma parte de mica ~0,1 milímetros na espessura tem ambos os lados clivados frescos. (B) A peça de mica clivada é prontamente colocada diagonalmente em uma cubeta contendo a solução APS e é colocada em incubação por 30 min. (C) Após a etapa de funcionalização da APS, a peça de mica APS é transferid...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CENP-A/H4)2, humano recombinante	EpiCypher, Durham, Carolina do Norte	16-0010	Número de catálogo para 50 ug
H2A/H2B, humano recombinante	EpiCypher, Durham, Carolina do Norte	15-0311	Número de catálogo para 50 ug
H3 Octâmero, humano recombinante	EpiCypher, Durham, Carolina do Norte	16-0001	Número de catálogo para 50 ug
Kit de dispositivo de diálise Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Nº 69574	Número de catálogo para 10 dispositivos
cloreto de sódio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	Número de catálogo para 500 mg
Filtros centrífugos Amicon Ultra-0.5 mL	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	Número de catálogo para 8 dispositivos
Hcl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Rolamento 258148-25ML	Número de catálogo para 25 mL
Tricina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	Número de catálogo para 25 g
Sds	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	Número de catálogo para 1 kg
Persulfato de amônio (AmmPS)	Bio-Rad, Hércules, CA	Rolamento 1610700	Número de catálogo para 10 g
Solução de Acrilamida / Bis a 30%, 37,5: 1	Bio-Rad, Hércules, CA	1610158	Número de catálogo para 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hércules, CA	Rolamento 1610800	Número de catálogo para 5 mL
4x tampão de amostra de proteína Laemmli para SDS-PAGE	Bio-Rad, Hércules, CA	1610747	Número de catálogo para 10 mL
2-ME	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	Número de catálogo para 10 mL
ageRuler Escada de Proteína Prestada	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Rolamento 26616	Número de catálogo para 500 uL
Mancha Coomassie Bio-Segura™	Bio-Rad, Hércules, CA	1610786	Número de catálogo para 1 L
Toalhetes de sala limpa não tecidos: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, Carolina do Norte	TX604
Bloco de Moscovita Mica	AshevilleMica, Newport News, VA	Grau 1
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	Número de catálogo para 25 g
Fita adesiva	Scotch-3M, São Paulo, MN
Ponta de prova do afm de TESPA-V2 (para a imagem latente estática)	Sondas Bruker AFM, Camarillo, CA
Filtro Millex-GP, 0,22 μm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	Número de catálogo para 10 dispositivos
Ponta de prova do afm de BL-AC10DS-A2 (para HS-AFM)	Olympus, Japão
Microscópio de Força Atômica Multimodo	Bruker-Nano / Veeco, Santa Bárbara, CA