Microscopia de Força Atômica de Lapso de Tempo de Alta Velocidade para Capturar a Dinâmica do Nucleossomo

Resumo

Fonte: Stumme-Diers, M. P., et al., Sondando a estrutura e a dinâmica dos nucleossomos usando imagens de microscopia de força atômica.J. Vis. Exp.(2019)

Neste vídeo, demonstramos técnicas de microscopia de força atômica de lapso de tempo de alta velocidade, AFM, para estudar a dinâmica dos complexos de nucleossomos. À medida que a ponta do AFM varre a superfície do nucleossomo, ela detecta alterações na altura do nucleossomo e registra o desdobramento do DNA ao longo do tempo.

Protocolo

1. Conjunto de diluição contínua de mononucleossomos

1. Gere e purifique um substrato de DNA de aproximadamente 400 pb que contém uma sequência de posicionamento do nucleossomo Widom 601 descentralizada.
   nota: Para limitar a formação indesejada de dinucleossomos, cada 'braço' flanqueando a sequência de posicionamento não deve exceder ~ 150 pb.
   1. Use o plasmídeo pGEM3Z-601 junto com os primers projetados e amplifice o DNA do substrato usando PCR. Para o substrato de 423 pb com comprimentos de braço de 122 e 154 pb usado aqui, use primers direto (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') e reverso (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3').
   2. Adicionar tubos contendo a mistura de reação a um termociclador pré-aquecido a 95 °C. Executar o seguinte programa durante 33 ciclos após uma desnaturação inicial durante 5 min a 95 °C: 30 s de desnaturação a 95 °C, 30 s de recozimento a 49 °C e 35 s de extensão a 72 °C. Definir uma extensão final a 72 °C durante 10 min após os 33 ciclos.
   3. Purifique o DNA da mistura de PCR usando um kit de purificação de PCR disponível comercialmente. Ao eluir o DNA da coluna de limpeza de PCR, use tampão Tris 10 mM (pH 7,5) no lugar do tampão de eluição fornecido pelo kit.
      nota: Tome cuidado extra para não transferir tampões entre as etapas de purificação. Um eluente contaminado pode causar problemas a jusante ao medir a concentração de DNA e/ou pode alterar a concentração de sal inicial da mistura de montagem do nucleossomo.
2. Determinar a concentração de ADN medindo a absorvância do ADN purificado a 260 nm.
   1. Colete um branco no espectrofotômetro VIS UV usando apenas o tampão de eluição Tris pH 7.5 de 10 mM. Colete uma medida do DNA purificado.
3. Com a concentração determinada, alíquota de 25 pmol do DNA purificado em um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL e coloque-o em uma centrífuga a vácuo até que a solução seja pouco visível; isso é tipicamente de 30 min a 1 h.
   nota: O substrato de DNA agora está pronto para a montagem do nucleossomo. Caso contrário, o protocolo pode ser pausado aqui e o DNA armazenado a -20 °C até o uso.
4. Coloque o tubo de microcentrífuga contendo o DNA de 25 pmol no gelo e adicione os componentes de montagem do nucleossomo na Tabela 1, na ordem listada. Quando todos os componentes tiverem sido adicionados, retire a mistura do gelo e incube em temperatura ambiente (RT) por 30 min.
   nota: É fundamental que o teor de sal do tampão de histona de estoque seja considerado ao calcular o NaCl necessário para atingir a concentração final de 2 M.
5. Montar os nucleossomas reduzindo a concentração de sal de 2 M da mistura para 200 mM utilizando uma diluição contínua.
   1. Encha uma seringa com 100 μL de tampão de diluição contendo 10 mM Tris pH 7,5 e coloque-a em uma bomba de seringa.
   2. Direcione a agulha da seringa através de um orifício pré-perfurado na tampa do tubo de microcentrífugas, garantindo que o contato seja feito com a mistura de montagem (Figura 1).
   3. Opere a bomba de seringa a uma taxa de 0.75 μL/min por 120 min.
      nota: A solução resultante de 100 μL contém 250 nM de nucleossomos e 200 mM de NaCl.
   4. Transfira a mistura para um botão de diálise MWCO de 10 K e dialise contra 200 ml de um tampão pré-arrefecido (4 °C) com baixo teor de sal contendo 10 mM de Tris pH 7,5, 0,25 mM de EDTA e 2,5 mM de NaCl, durante 1 hora a 4 °C.
6. Para avaliar o conteúdo de histonas da montagem do nucleossomo, prepare um gel SDS-PAGE descontínuo com separação de 15% e empilhamento de 6%, conforme descrito anteriormente.
   1. Alíquota de 10 - 20 μL do estoque de nucleossomo a um tubo de microcentrífuga e adicione 4x Laemmli Sample Buffer a uma concentração de trabalho de 1 - 2x.
   2. Como controle, repita esta preparação em um tubo de microcentrífuga separado para 1 - 2 μg do estoque de histonas. Aqueça as amostras a 95 °C por ~ 5 min.
   3. Coloque as amostras em pistas adjacentes umas às outras no gel. Adicione buffer de amostra às faixas não utilizadas para promover a migração de banda uniforme.
   4. Execute o gel a 65 V até que a frente do corante se mova através do gel de empilhamento. Quando o gel de separação for alcançado, aumente-o para 150 V e deixe correr até que a frente do corante tenha migrado completamente para fora do gel.
   5. Desmonte a unidade de eletroforese e transfira suavemente o gel para um recipiente de coloração cheio de dd H₂O. Deixe o gel agir por 5 min com agitação suave. Repita este processo mais duas vezes com dd H₂O fresco usado a cada vez.
      nota: A coloração de Coomassie usada neste protocolo não requer as etapas de fixação típicas necessárias para manchas de Coomassie (consulte a Tabela de Materiais). Se outra preparação Coomassie estiver sendo usada, ajuste as etapas de fixação conforme necessário.
   6. Remova a água do enxágue final e adicione mancha apenas o suficiente para cobrir o gel. Deixe o gel descansar com agitação suave por pelo menos 1 h.
      nota: Para a agitação, o recipiente de coloração pode ser colocado em qualquer aparelho que promova o movimento da mancha sobre o gel, mantendo o gel coberto de líquido.
   7. Remova a mancha do recipiente e enxágue o gel com dd H₂O. Substitua o dd H₂O e deixe o gel de molho por 30 min com agitação suave. (O gel deve ter a mesma aparência mostrada na Figura 2, com separação clara das bandas de histonas.)
7. Armazenar os nucleossomas a 4 °C até à utilização.
   nota: Quando armazenados nessas condições, os nucleossomos permanecem estáveis por vários meses. O protocolo pode ser pausado aqui.

2. Imagem de alta velocidade do AFM da Time-lapse da dinâmica do nucleossomo

NOTA: O protocolo abaixo é fornecido para o instrumento HS-AFM desenvolvido pelo grupo Ando (Universidade de Kanazawa, Kanazawa, Japão).

1. Prepare APS-mica para imagens líquidas.
   1. Prenda a haste de vidro ao estágio do scanner AFM usando a cola do scanner de haste de vidro (consulte a Tabela de Materiais). Deixe secar por no mínimo 10 min.
   2. Faça pedaços circulares de mica de ~0,1 mm de espessura com 1,5 mm de diâmetro, perfurando-os de uma folha de mica maior. Use a cola de haste de vidro de mica HS-AFM (consulte a Tabela de Materiais) para prender esta peça de mica à haste de vidro no HS-AFM e seque, intocada por no mínimo 10 minutos. Corte as camadas usando uma fita sensível à pressão até que uma camada bem clivada seja vista na fita.
   3. Diluir 1 μL de estoque APS 50 mM em 99 μL de dd H₂O para fazer uma solução APS 500 μM. Deposite 2,5 μL desta solução na superfície da mica recém-clivada e deixe funcionalizar por 30 min.
      nota: Para evitar o ressecamento da superfície durante a funcionalização, a tampa de um tubo de centrífuga cônico de 50 mL pode ser encaixada com um pedaço úmido de papel de filtro e colocada sobre o scanner. O estoque APS é diluído 3 vezes menos para imagens líquidas do que para imagens estáticas para controlar a dinâmica a uma taxa que pode ser observada com AFM.
   4. Enxágue a mica com 20 μL de dd H₂O aplicando vários enxágues de ~ 3 μL. Remova a água completamente após cada enxágue, colocando um pano não tecido na borda da mica. Após o enxágue final, coloque ~ 3 μL de dd H₂O na superfície e deixe descansar por no mínimo 5 min para remover qualquer APS não especificamente ligado.
2. Coloque a sonda no suporte HS-AFM e posicione o suporte no estágio AFM com a ponta voltada para cima. Enxágue o suporte usando ~ 100 μL de dd H₂O seguido por dois enxágues de ~ 100 μL de tampão de imagem de nucleossomos filtrados de 0.22 μm que contém 10 mM HEPES pH 7.5 e 4 mM MgCl₂.
3. Com os enxágues feitos, encha a câmara com ~ 100 μL de tampão de imagem de nucleossomo, submergindo a ponta. Ajuste a posição do cantilever até que seja atingida pelo laser. Enxágue a APS-mica com 20 μL de tampão de imagem de nucleossomo filtrado, usando ~ 4 μL por enxágue.
4. Diluir 1 μL do estoque de montagem de nucleossomos em 250 μL de tampão de imagem de nucleossomos filtrado para uma concentração final de nucleossomos de 1 nM. Deposite 2,5 μL desta diluição na superfície e deixe descansar por 2 min. Enxágue a superfície com ~ 4 μL de tampão de imagem de nucleossomo duas vezes. Após o enxágue final, deixe a superfície coberta pelo tampão de imagem.
   nota: Se a superfície não for enxaguada após a deposição da amostra de nucleossomo, a superfície ficará rapidamente superlotada.
5. Coloque o scanner e a amostra na parte superior do suporte da ponta para que a amostra fique voltada para baixo. Para iniciar a aproximação, use a função de aproximação automática com uma amplitude de ponto de ajuste, A_s próxima à amplitude de oscilação livre A₀.
   nota: Idealmente, A_s = 0,95 A₀, no entanto, operar a 82% de A₀ também funcionará se for cuidadoso.
6. Ajuste o ponto de ajuste até que a superfície esteja sendo bem rastreada.
   nota: Para minimizar a transferência de energia da ponta do AFM para a amostra de nucleossomo, a amplitude do cantilever deve ser mantida pequena, com amplitudes tão baixas quanto 1 nm ideal.
7. Defina a área da imagem em torno de 150 x 150 nm a 200 x 200 nm com uma taxa de aquisição de dados de ~300 ms por quadro de imagem.
   nota: Esse tamanho de imagem é normalmente suficiente para capturar a dinâmica de vários nucleossomos simultaneamente. Uma superfície menos povoada pode exigir alterações nesses parâmetros. A taxa de quadros sugerida é suficiente para capturar a dinâmica do nucleossomo, como looping, deslizamento e desdobramento, entre outros (consulte a seção Resultados representativos abaixo).

Tabela 1: Reagentes necessários para a montagem contínua do nucleossomo do gradiente de sal. Cada um dos componentes listados é adicionado ao tubo de microcentrífuga contendo o DNA purificado. Isso deve ser feito na ordem em que os reagentes são listados na tabela, com água e NaCl adicionados primeiro, seguidos pelo dímero H2A / H2B e o tetrâmero de histona adicionados por último. Se forem usados octâmeros de histonas pré-dobrados, adicione-os na mesma proporção do tetrâmero acima. * Anote o conteúdo de NaCl em cada um dos estoques de histonas e ajuste o NaCl 5M para adicionar de acordo, o [NaCl] final deve ser igual a 2M. (Ver Tabela de Materiais).

Resultados

Figura 1: Esquema da bomba de seringa usada para montagem de nucleossomos em microescala.A mistura de montagem é posicionada de forma a estar em contacto com a extremidade da agulha da seringa. À medida que o tampão de diluição é fornecido pela bomba de seringa à mistura de montagem, a concentração de NaCl diminui, promovendo a montagem de nucleossomas. Esta figura é adaptada de Stumme-Diers et al.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Plasmídeo pGEM3Z-601	Addgene, Cambridge, MA	Rolamento 26656
Primers de PCR	IDT, Coralville, IA	Pedido personalizado	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
Polimerase DreamTaq	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	EP0701	Número de catálogo para 200 unidades
Kit de purificação de PCR	Qiagen, Hilden, Alemanha	Rolamento 28104	Número de catálogo para 50 unidades
Base Tris	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	10708976001	Número de catálogo para 250 g
Edta	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	15576028	Número de catálogo para 500 g
(CENP-A/H4)2, humano recombinante	EpiCypher, Durham, Carolina do Norte	16-0010	Número de catálogo para 50 ug
H2A/H2B, humano recombinante	EpiCypher, Durham, Carolina do Norte	15-0311	Número de catálogo para 50 ug
H3 Octâmero, humano recombinante	EpiCypher, Durham, Carolina do Norte	16-0001	Número de catálogo para 50 ug
Kit de dispositivo de diálise Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Nº 69574	Número de catálogo para 10 dispositivos
cloreto de sódio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	Número de catálogo para 500 mg
Filtros centrífugos Amicon Ultra-0.5 mL	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	Número de catálogo para 8 dispositivos
Hcl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Rolamento 258148-25ML	Número de catálogo para 25 mL
Tricina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	Número de catálogo para 25 g
Sds	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	Número de catálogo para 1 kg
Persulfato de amônio (AmmPS)	Bio-Rad, Hércules, CA	Rolamento 1610700	Número de catálogo para 10 g
Solução de Acrilamida / Bis a 30%, 37,5: 1	Bio-Rad, Hércules, CA	1610158	Número de catálogo para 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hércules, CA	Rolamento 1610800	Número de catálogo para 5 mL
4x tampão de amostra de proteína Laemmli para SDS-PAGE	Bio-Rad, Hércules, CA	1610747	Número de catálogo para 10 mL
2-ME	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	Número de catálogo para 10 mL
PageRuler Escada de Proteína Prestained	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Rolamento 26616	Número de catálogo para 500 uL
Mancha Coomassie Bio-Segura™	Bio-Rad, Hércules, CA	1610786	Número de catálogo para 1 L
Toalhetes de sala limpa não tecidos: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, Carolina do Norte	TX604
Bloco de Moscovita Mica	AshevilleMica, Newport News, VA	Grau 1
Aminopropilsilatrano (APS)	Sintetizado conforme descrito em 22
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	Número de catálogo para 25 g
Fita adesiva	Scotch-3M, São Paulo, MN
Cola Industrial Krazy Aron Alpha	Toagosei América, West Jefferson, OH	AA480	Número de catálogo para bisnaga de 2 g
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M8266-100G	Número de catálogo para 100 g
Filtro Millex-GP, 0,22 μm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	Número de catálogo para 10 dispositivos
Ponta de prova do afm de BL-AC10DS-A2 (para HS-AFM)	Olympus, Japão
Composto FG-3020C-20	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japão
Composto FS-1010S135-0.5	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japão
Microscopia de Força Atômica de Lapso de Tempo de Alta Velocidade	Toshio Ando, Instituto de Ciências da Nano-Vida, Universidade de Kanazawa, Kakuma-machi, Kanazawa, Japão