$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local
1. Fixação primária, pós-fixação, incorporação, seccionamento e contraste
- Prepare 1,6 mL de solução fixadora primária (glutaraldeído a 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,3)) em um tubo de microcentrifugação de 2 mL. Armazená-lo a 5 °C por no máximo 14 dias.
- Da biópsia muscular ou músculo inteiro, isole uma amostra pequena, que tenha um diâmetro máximo de 1 mm em qualquer direção e seja um pouco mais longa na direção da fibra longitudinal do que transversalmente (para fins de orientação).
- Coloque a amostra no tubo que contém a solução de fixação primária fria. Armazene-o a 5 °C por 24 h.
- Lave a amostra quatro vezes (15 min entre cada lavagem) em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,3). Usando pipetas de transferência, remova o tampão usado do tubo deixando a amostra intocada e, em seguida, adicione o tampão fresco.
nota: Após a lavagem final, a amostra pode ser armazenada no tampão de cacodilato de sódio 0,1 M a 5 °C por vários meses. O protocolo pode ser pausado aqui.
- Postfix com tetróxido de ósmio a 1% (OsO4) e ferrocianeto de potássio a 1,5% (K4Fe(CN)6) em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,3) por 120 min a 4 °C.
nota: O uso de ferrocianeto de potássio a 1,5% (K4Fe(CN)6) é essencial para um contraste ideal das partículas de glicogênio.
- Enxágüe duas vezes em água bidestilada em temperatura ambiente (RT).
- Desidratar submergindo em uma série graduada de álcool (etanol) em RT usando as seguintes concentrações: 70% (10 min), 70% (10 min), 95% (10 min), 100% (10 min) e 100% (10 min).
nota: Em cada etapa, a amostra é submersa em etanol, que é posteriormente removido apenas parcialmente para evitar a secagem da amostra. Por fim, o etanol restante é descartado.
- Infiltrar-se com misturas graduadas de óxido de propileno e resina epossídica em RT usando as seguintes proporções de volume (óxido de propileno/resina epossídica): 1/0 (10 min), 1/0 (10 min), 3/1 (45 min), 1/1 (45 min), 1/3 (45 min), 0/1 (durante a noite). No dia seguinte, embutir amostras em resina epossídica 100% fresca em moldes e polimerizar a 60 °C por 48 h.
- Corte seções ultrafinas (60-70 nm) de fibras orientadas longitudinalmente e colete-as em grades de cobre de um orifício da seguinte maneira.
- Monte o bloco de uma amostra no suporte do ultramicrótomo.
- Apare o bloco na superfície com uma lâmina de barbear para atingir o nível do tecido.
- Monte uma faca de diamante (ultra corte 45) na frente da amostra e alinhe a superfície da amostra paralela à faca.
- Produzir uma secção semifina (1 μm) com a faca diamantada para verificar a orientação da amostra. Manchar a seção semifina com azul de toluidina para observação com microscopia de luz.
- Apare ainda mais o bloco para reduzir a área de interesse, a fim de obter seções ultrafinas adequadas.
- Corte seções ultrafinas (60-70 nm) com uma segunda faca diamantada (ultra corte 45).
- Colete 1-2 seções em grades de cobre de um furo usando um Perfect Loop.
nota: A grade de cobre de um furo tem um único orifício no meio com membrana de suporte Formvar.
- Contraste as seções com acetato de uranila e citrato de chumbo imergindo as grades acima em solução de acetato de uranila (0,5% em água bidestila) por 20 min e, em seguida, em solução de citrato de chumbo (1% em água bidestilada Lave as grades em água bidestilada entre e após as duas manchas.
nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Exames de imagem
- Ligue o microscópio eletrônico de transmissão (operado a uma tensão de aceleração de 80 kV), computador e software de gravação de imagens. Grave imagens digitais com uma câmera CCD digital de varredura lenta de 2 k x 2 k e o software de imagem associado.
- Insira a grade com várias seções no microscópio stage.
- Filtre a grade inicialmente em baixa ampliação (por exemplo, x100) para determinar a qualidade das seções (ou seja, furos na membrana de suporte, detritos, etc.) e escolha as seções de melhor qualidade. Em baixa ampliação, determine a direção das fibras musculares.
- Em seguida, aumente a ampliação com o feixe centralizado em uma fibra periférica na seção. Foque a imagem com ampliação acima de 30 k para garantir detalhes finos suficientes na imagem, guiados por uma transformação rápida de Fourier em tempo real, se disponível. Por fim, grave imagens com tempo de exposição de 1 s na ampliação desejada.
- Adquirir um total de 24 imagens de uma fibra selecionada aleatoriamente, ou seja, 12 imagens do espaço miofibrilar e 12 imagens do espaço subsarcolemal, com uma ampliação entre 10 k e 40 k. Garantir que as imagens estejam distribuídas ao longo do comprimento e largura da fibra em uma ordem aleatória, mas sistemática, para obter resultados imparciais (Figura 1A).
nota: A ampliação ideal depende da resolução da câmera disponível e do tamanho das micrografias. O objetivo é alcançar uma resolução final, onde os diâmetros das partículas de glicogênio possam ser medidos em etapas de 1 nm, e incluir uma área total da região miofibrilar de pelo menos 70 μm2 e um comprimento total da fibra de pelo menos 25 μm distribuídos em 12 imagens do espaço miofibrilar e 12 imagens do espaço subsarcolemal por fibra, respectivamente. As 24 imagens por fibra provavelmente fornecerão uma precisão (coeficiente de erro) do conteúdo volumétrico dos diferentes pools de glicogênio entre 0,1 e 0,2 em fibras individuais de músculos esqueléticos humanos, ratos e camundongos (Figura 2E).
- Repita as etapas 2.4 e 2.5 até que um total de 6 a 10 fibras sejam visualizadas. Se necessário, corte seções adicionais (separadas por pelo menos 150 μm para evitar a sobreposição de fibras já visualizadas) e repita as etapas 1,9 a 2,5.
3. Análise de imagem
- Importe imagens para o ImageJ clicando em Arquivo > Abrir.
- Defina a escala global para corresponder ao tamanho original da imagem clicando em Analisar > Definir escala.
- Aumente o zoom 100% clicando na imagem > amplie > in.
- Meça a espessura de um disco Z por imagem do espaço miofibrilar (12 por fibra) usando a ferramenta Linha Reta no menu Ferramentas (Figura 1D). Calcule a espessura média do disco Z de cada uma das 6-10 fibras.
- Defina 2-3 fibras com o disco Z médio mais espesso como fibras tipo 1 e 2-3 fibras com o disco Z médio mais fino como fibras tipo 2. Desconsiderar as 2-4 fibras intermediárias para análises posteriores (Figura 1E).
NOTA: As etapas a seguir são repetidas para cada uma das 4-6 fibras da amostra. As frações de volume de glicogênio são estimadas por contagem de pontos. O tamanho das grades é escolhido para obter uma alta precisão satisfatória das estimativas. Isso geralmente é obtido ao atingir 250 acertos, o que determina o número total de pontos necessários e, por sua vez, a área por ponto.
- Use a ferramenta Linha Segmentada para medir o comprimento da miofibrila mais externa visível logo abaixo da região subsarcolemal (Figura 2A).
nota: Esse comprimento é usado para expressar glicogênio subsarcolemal por área de superfície (ou seja, comprimento da miofibrila mais externa multiplicado pela espessura da seção (60 nm); consulte a etapa 4.5). Portanto, apenas a região subsarcolemal, que é representada por esse comprimento, é incluída na análise.
- Insira uma grade clicando em Analisar > Ferramentas > Grade e defina Área por ponto em 32.400 nm2. Conte o número de acertos dentro do comprimento disponível nas 12 imagens subsarcolemais, onde uma cruz atinge o glicogênio subsarcolemal ( Figura 2A ). Um acerto é definido como uma partícula de glicogênio presente no canto superior direito de uma cruz.
- Insira uma grade clicando em Analisar > Ferramentas > Grade e defina Área por ponto em 160.000 nm2. Conte o número de acertos nas 12 imagens miofibrilares, onde uma cruz atinge o espaço intramiofibrilar (Figura 2B).
- Insira uma grade clicando em Analisar > Ferramentas > Grade e defina Área por ponto em 3.600 nm2. Conte o número de acertos nas 12 imagens miofibrilares, onde uma cruz atinge o glicogênio intramiofibrilar (Figura 2C).
- Insira uma grade clicando em Analisar > Ferramentas > Grade e defina Área por ponto em 32.400 nm2. Conte o número de acertos nas 12 imagens miofibrilares, onde uma cruz atinge o glicogênio intermiofibrilar (Figura 2D).
- Usando a ferramenta Linha Reta, meça o diâmetro de cinco partículas de glicogênio escolhidas aleatoriamente de cada pool para cada uma das 12 imagens para obter uma média de 60 partículas por pool por fibra.
NOTA: A média de 60 partículas cobre em grande parte a variação dentro da fibra (Figura 2F).
