1. Linhagem celular e cultura celular
- Cultive macrófagos RAW 264,7 no meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% (vol / vol) de soro fetal bovino inativado por calor (FBS), 100 UI / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5% de CO2. Substitua os meios de crescimento a cada dois dias.
- Quando as células se tornarem 80% confluentes, lave a placa duas vezes usando PBS estéril.
- Separe as células adicionando 1.000 μL de tripsina-EDTA a 0,5% e incube a placa de cultura de células por 3-5 min em uma incubadora umidificada a 37 ° C.
- Examine a placa sob um microscópio óptico para confirmar a dissociação celular. Adicione 10 mL de meio de crescimento contendo 10% de FBS para inativar a tripsina.
- Colete a suspensão celular em um tubo cônico de 50 mL e centrifugue a 400 x g por 5 min à temperatura ambiente. Ressuspenda suavemente as células no meio de cultura celular completo e determine a contagem e a viabilidade das células usando a coloração com azul de tripano (0,4%).
nota: A viabilidade celular mínima recomendada para este experimento é de >90%.
- Coloque lamínulas de vidro estéreis em poços de uma placa de 24 poços usando uma pinça autoclavada. Semear células em lamínulas a uma densidade de 1 x 106 células/mL e incubar a placa durante a noite em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2.
- Troque o meio de cada poço com um novo meio completo de 500 μL antes do tratamento. Pré-trate os macrófagos com veículo (DMSO ou outros solventes usados para dissolver EIPA) ou o inibidor de macropinocitose 5-(N-etil-N-isopropil)-amilorida (EIPA, 25 μM) por 30 min.
- Tratar células com veículo e estimuladores de macropinocitose para promover o rugido da membrana: forbol 12-miristato 13-acetato (PMA, 1 μM, 30 min) e fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF, 100 ng/mL, 30 min).
nota: Inibidores alternativos [por exemplo, latrunculina A (1 μM, 30 min) ou citocalasina D (1 μM, 30 min)] e estimuladores [por exemplo, fator de crescimento epidérmico (EGF, 100 ng/mL, 10 min) ou fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF, 100 ng/mL, 15 min)] de macropinocitose também podem ser usados para caracterizar macropinocitose em macrófagos e outros tipos celulares. As células podem necessitar de inanição sérica durante a noite antes do tratamento com estimuladores fisiológicos da macropinocitose. É importante notar que as concentrações e tempos de incubação mais eficazes terão que ser determinados para estimular a macropinocitose em outros tipos de células.
2. Fixação de MEV
- Após o tratamento, aspire o meio dos poços e lave as lamínulas com PBS gelado duas vezes.
- Fixe as células (paraformaldeído a 4% e glutaraldeído a 2% em cacodilato de sódio 0,1 M) por 30 min à temperatura ambiente, seguido de incubação noturna no fixador a 4 ° C.
- Lave e incube suavemente as lamínulas com 500 μL dos seguintes reagentes sem perturbar a monocamada celular.
- Lave uma vez em cacodilato de sódio 0,1 M e incube por 15 min.
- Lavar duas vezes com dH2O com 10 min de incubação em cada lavagem.
- Lavar duas vezes com etanol a 25% com 10 min de incubação em cada lavagem.
- Lavar duas vezes com etanol a 50% com 10 min de incubação em cada lavagem.
- Lave duas vezes com etanol 75% com 10 min de incubação em cada lavagem.
- Lave duas vezes com etanol a 80% com 10 min de incubação em cada lavagem.
- Lavar duas vezes com etanol a 95% com 10 min de incubação em cada lavagem.
- Lave duas vezes com etanol 100%. Realize 10 min de incubação em cada lavagem.
nota: A troca/substituição de reagentes deve ser feita rapidamente para evitar o ressecamento das células ao ar. As lamínulas podem ser deixadas em etanol 100% por vários dias a 4 °C. Para armazenamento de longo prazo, adicione mais etanol 100% e cubra os poços com parafilme para evitar a secagem da amostra ao ar.
3. Secagem do ponto crítico
- Coloque as lamínulas em um secador de pontos críticos e cubra-as com 100% de etanol. Pressione o botão Power e abra o tanque de CO2.
- Pressione o botão Cool por aproximadamente 30 s até que a temperatura diminua para 0 °C. Pressione o botão Fill até que uma bolha apareça na janela da câmara.
- Pressione o botão Purge até que o cheiro de etanol do escapamento de purga desapareça. Pressione o botão Cool novamente até que a temperatura diminua para 0 °C.
- Pressione novamente os botões Fill e Purge para desligá-los e fechar o tanque de CO2. Pressione novamente o botão Cool para desligá-lo e pressione o botão Heat.
- Defina a temperatura em 42 °C e a pressão em 1.200 psi. Assim que a pressão e a temperatura se estabilizarem, pressione o botão Sangrar para permitir que a pressão diminua lentamente.
- Quando a pressão da câmara atingir 150 psi, pressione o botão Vent e espere até que a pressão diminua para 0 psi. Desligue o secador de ponto crítico e remova as lamínulas.
- Monte lamínulas em montagens de amostras de alumínio SEM usando abas adesivas de carbono e sujeitas a revestimento por pulverização catódica usando ouro/paládio em um revestidor por pulverização catódica.
- Ligue o botão Liga / Desliga e aguarde até que o vácuo atinja 30 mTorr. Lave a câmara para remover a umidade e o ar desligando o interruptor de gás e girando a válvula de gás fino no sentido anti-horário.
- Quando o vácuo aumentar para 200 mTorr, desligue o interruptor de gás e espere até que o vácuo atinja 30 mTorr. Repita esta etapa 3 vezes.
- Pressione o botão Timer e ajuste o voltage botão até que o medidor leia 10 mA. Remova as lamínulas revestidas da câmara.
nota: Siga as instruções do fabricante para realizar a secagem em pontos críticos e o revestimento por pulverização catódica da amostra.
4. Imagem e quantificação
- Inserir lamínulas de amostra na câmara de um microscópio eletrônico de varredura. Feche a porta e pressione o botão Evac.
- Abra o software de operação SEM. Defina a tensão de aceleração para 15 kv e a distância de trabalho para 10 mm.
- Pressione o botão Coordenadas e mova-se pelo controlador até que as células apareçam no centro da tela de observação. Defina a ampliação para 3.500x e crie a imagem da amostra clicando no botão Foto.
nota: Use um nível mais alto de ampliação (8.500x a 16.000x) para mostrar a membrana plasmática com mais detalhes.
