Quantificação da formação de babados de membrana usando microscopia eletrônica de varredura

Abstract

Fonte: Ahn, W. et al., Visualizando a formação de babados de membrana usando microscopia eletrônica de varredura.J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a preparação de amostras, fixação e imagem de uma célula de macrófago que exibe babados de membrana usando microscopia eletrônica de varredura, SEM. Informações detalhadas sobre a morfologia e organização da membrana são cruciais para entender a condição fisiológica das células.

Protocol

1. Linhagem celular e cultura celular

1. Cultive macrófagos RAW 264,7 no meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% (vol / vol) de soro fetal bovino inativado por calor (FBS), 100 UI / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5% de CO₂. Substitua os meios de crescimento a cada dois dias.
2. Quando as células se tornarem 80% confluentes, lave a placa duas vezes usando PBS estéril.
3. Separe as células adicionando 1.000 μL de tripsina-EDTA a 0,5% e incube a placa de cultura de células por 3-5 min em uma incubadora umidificada a 37 ° C.
4. Exam....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5% de tripsina-EDTA	Gibco	Rolamento 15400-054
2% de glutaraldeído	Ciências da Microscopia Eletrônica	Rolamento 16320
4% de paraformaldeído	Santa Cruz Biotecnologia	281692
5-(N-etil-N-isopropil)-amilorida	Sigma Ciências da Vida	Resposta 3085
Abas adesivas de carbono	Ciências da Microscopia Eletrônica	Nº 77825-09
Dimetilsulfóxido	Corning	25-950-CQC
Meio Eagle Modificado de Dulbecco	Ciências da Vida Cytiva	SH30022.01
Placa de Cultura de Células Multipoços Tratadas com TC de Fundo Plano Transparente Falcon de 24 poços	falcão	353047
Soro fetal bovino	Biografia de Gêmeos	900-108
Incubadora de CO2 HERAcell 150i	Thermo Fisher Científico	51026282
Revestidor de pulverização catódica Hummer Modelo 6.2	Anatech EUA	Rolamento 58565
Microscópio eletrônico de varredura JSM-IT500HR
Vidro de cobertura do microscópio	Thermo Fisher Científico	12-545-82
Estreptococos de caneta	Gibco	15140-122
Acetato de forbol 12-miristato 13	Millipore Sigma	Rolamento 524400
Macrófagos RAW 264.7	ATCC	ATCC TIB-71
M-CSF humano recombinante	Peprotech	300-25
Samdri-790 Secador de Ponto Crítico	Corporação de Pesquisa Tousimis	8778B
Montagens de amostra de alumínio SEM	Ciências da Microscopia Eletrônica	Rolamento 75220
Cacodilato de sódio	Ciências da Microscopia Eletrônica	12300
Solução Trypan Blue	Thermo Fisher Científico	15250061