Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Pré-arranjo dos animais
- Pese um camundongo e carregue o respectivo medicamento (por exemplo, o canabinóide, 5 mg / kg de peso corporal (pc)) em uma seringa de insulina. Administre o medicamento 30 minutos antes da indução do trombo.
- Segurando o pescoço do camundongo entre o polegar e o dedo indicador e a cauda do camundongo com o dedo mindinho, estique o animal e injete a droga por via intraperitoneal (ip) no quadrante inferior esquerdo do abdômen. Coloque o animal de volta na gaiola por 15 min.
- Prepare a anestesia com cetamina (90 mg / kg de peso corporal) e xilazina (25 mg / kg de peso corporal). 15 minutos antes da indução do trombo, anestesiar o camundongo. Coloque o camundongo na gaiola, puxe levemente a cauda e injete o anestésico ip com uma seringa de insulina.
- Coloque o mouse de volta na gaiola até o início da anestesia. Para verificar a anestesia suficiente, aperte a cauda com uma pinça.
- Carregue 0,05 mL de dextrano marcado com isotiocianato de fluoresceína descongelado (FITC-dextrano; 5%, 150 kDa) em uma seringa de insulina. Ao encher a seringa, certifique-se de que não restam bolhas de ar, pois mesmo pequenas bolhas de ar administradas por via intravenosa (iv) podem ser letais para o animal.
- Coloque o mouse anestesiado em uma placa de aquecimento na posição virada para baixo. Ajuste a placa de aquecimento para 37 °C.
- Coloque pomada para os olhos na córnea do camundongo. Desinfete a pele e use instrumentos estéreis.
- Costure duas suturas de polipropileno 7/0 na borda cranial e caudal da orelha direita. Coloque os pontos o mais próximo possível da borda e o mais próximo possível da base (Figura 1B).
- Desloque o mouse para a posição dorsal. Fixe todas as pernas à plataforma de vidro acrílico usando tiras adesivas. Prenda uma sutura sob os dentes da frente e posicione a cabeça em dorsiflexão colando a sutura no vidro acrílico com tiras adesivas.
- Transloque o animal na plataforma sob o estereomicroscópio de operação. Use ampliação de 16X.
2. Preparação da Veia Jugular Esquerda e Injeção de FITC-Dextrano
Nota: Para microscopia da orelha direita, prepare a veia jugular esquerda.
- Usando um bisturi, faça uma incisão de 5 mm na pele do lado esquerdo do pescoço na direção craniocaudal. Disseque o tecido subcutâneo com micropinças e microtesouras. Ligar vasos cruzados com suturas de poliéster 8/0 ou com eletrocoagulação.
- Liberte a veia de sua adventícia usando microfórceps e microtesouras sem tocar no vaso.
- Use a seringa de insulina preparada para a injeção do corante fluorescente. Agarre cuidadosamente a parede do vaso com as micropinças, sem perfurar a veia. Penetre na parede do vaso distendido com a seringa e injete FITC-dextrano iv.
- Pare o sangramento após retirar a seringa usando cotonetes. Evite a contaminação do sangue e da tinta do ouvido.
3. Posicionamento da orelha direita para microscopia de fluorescência intravital
- Transfira o animal na placa de aquecimento para uma construção de vidro acrílico com uma ranhura para a placa de aquecimento e um plano de 0,5 cm de altura para posicionar a orelha.
- Fixe o animal de bruços na placa de aquecimento usando tiras adesivas. Coloque a cartilagem relativamente forte e convexa na base da orelha ao lado dos planos de 0,5 cm de altura para a orelha (Figura 1B) para que a parte apical da orelha possa ser posicionada plana no plano.
- Adicione uma gota de NaCl a 0,9% em temperatura ambiente ao plano de vidro acrílico para posicionar a orelha. Coloque a orelha direita, com as suturas pré-dispostas em seu lado ventral côncavo voltado para baixo, na queda de NaCl a 0,9%. Usando cotonetes, absorva a gota de NaCl e deixe as forças capilares prenderem o plano da orelha ao vidro acrílico.
- Prenda as suturas no vidro acrílico para fixar a posição da orelha.
- Adicione uma gota de NaCl a 0,9% à temperatura ambiente no lado dorsal convexo da orelha. Coloque cuidadosamente uma lamínula (0,5 cm de diâmetro) na orelha sem comprimir os vasos basais que entram na orelha. Usando cotonetes, remova o máximo possível de NaCl sob a lamínula para minimizar a distância entre a lamínula e os vasos alvo da orelha.
4. Microscopia de fluorescência intravital e indução de trombo da orelha direita
- Ajuste o microscópio de fluorescência intravital para visualização FITC-dextrana (450 - 490 nm; FT: 510; LP: 520). Use uma lâmpada de mercúrio variável de 100 W como fonte de luz. Conecte uma câmera CCD em preto e branco de alta resolução a um gravador de DVD.
- Transferir o animal sobre o vidro acrílico que contém a placa de aquecimento com a orelha abduzida fixa para a mesa do microscópio de fluorescência intravital.
- Usando ampliação de 20X (abertura numérica de 20X / 0,95) e intensidade de luz de 20%, procure um vaso venoso de 50 a 60 μm de diâmetro e com fluxo sanguíneo anterógrado de 400 a 600 μm / s.
- Adicione uma gota de água em temperatura ambiente à lamínula para imersão em água da objetiva de ampliação de 63x (abertura numérica de 63X/0,95). Use uma seringa com uma cânula de 1 mm de diâmetro e coloque a gota na objetiva do microscópio. Adicione água apenas o suficiente para entrar em contato com a lamínula e a objetiva com a gota d'água.
- Imediatamente após a aplicação da gota d'água, iniciar o registro do vaso por 20 s com 20% de intensidade luminosa para a medição off-line do diâmetro e do fluxo sanguíneo.
- Inicie a indução de trombos 5 minutos após a injeção de FITC-dextrano. Para isso, aumente a intensidade da luz para 100%.
- Durante a indução do trombo, feche a abertura do microscópio por 2 s em um período de 30 s para verificar o fluxo sanguíneo. Em caso de fluxo sanguíneo persistente, abra a abertura novamente. Em caso de parada do fluxo sanguíneo, observe o vaso por 30 s.
nota: O vaso é classificado como ocluído se o fluxo permanecer parado por 30 s ou mais ou se o sangue fluir de forma retrógrada. Se o fluxo sanguíneo ortorógrado começar novamente, abra completamente a abertura e continue a indução do trombo até que ocorra a oclusão do vaso, conforme descrito acima. Durante a indução precoce do trombo, certifique-se de que os tempos em que a abertura foi fechada para verificar o fluxo sanguíneo sejam os mais curtos possíveis, a fim de manter a epi-iluminação quase contínua. Mais tarde, durante o crescimento do trombo, o vaso é perfundido com um corante menos fluorescente, para que possa ser observado continuamente.
- Selecione e oclua 5 vasos por orelha. Limite o tempo de indução de trombo ao microscópio a aproximadamente 1 h após a injeção de FITC-dextrano.
