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Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Preparação das citospinas
- Prepare dois citospins com células mononucleares das amostras do paciente (ou seja, um cytospin para coloração de imunofluorescência γH2AX e um cytospin para coloração de imunofluorescência combinada γH2AX e 53BP1) por centrifugação (300 x g, 10 min) de 1,0 x 105 células para cada preparação (Figura 1 e 2).
2. Coloração de imunofluorescência γH2AX e 53BP1
- Fixação e permeabilização: Fixe as células com 200 μL de PFA a 4% por 10 min. Após a fixação, lave as células suavemente três vezes com 30 mL de PBS por 5 min cada em um agitador de laboratório. Em seguida, permeabilize as células com 200 μL de Octoxinol 9 a 0,1% por 10 min. Lave as células suavemente três vezes com 30 mL de solução bloqueadora a 5% por 5 min cada em um agitador de laboratório. Bloqueie as células em 30 mL de solução fresca de bloqueio a 5% por 1 h.
- Incubação com anticorpos
- Incubar uma preparação das células com um anticorpo monoclonal anti-γH2AX de ratinho (1:500) e a outra preparação das células com um anticorpo monoclonal anti-γH2AX de ratinho (1:500) e um anticorpo policlonal anti-53BP1 de coelho (1:500) durante a noite a 4 °C.
- Após a incubação, lave as células suavemente 3 vezes com 30 mL de solução bloqueadora a 2% a cada 5 minutos em um agitador de laboratório.
- Remova a solução de bloqueio e incube a primeira preparação das células com um anticorpo secundário anti-camundongo de cabra conjugado com Alexa488 (1:500) e a segunda preparação das células com um anticorpo secundário de cabra conjugado com Alexa488 (1:500) e um anticorpo secundário anti-coelho de burro conjugado com Alexa555 (1:500) por 1 h à temperatura ambiente.
- Meio de montagem: Coloque a lâmina com as células em uma tigela e lave as células suavemente três vezes com 30 mL de PBS a cada 5 min em uma coqueteleira de laboratório. Remova o PBS e monte as células com um meio de montagem contendo 4,6-diamidino-2-fenilindo. Coloque cuidadosamente uma lamínula em cima do meio de montagem para que nenhuma bolha de ar fique embutida. Aguarde pelo menos 3 h para o endurecimento do meio de montagem antes de analisar as células por microscopia de fluorescência.
3. Análise dos focos γH2AX e 53BP1
- Microscopia de fluorescência: Analise os focos γH2AX e 53BP1 nos núcleos celulares com um microscópio de fluorescência equipado com filtros para DAPI, Alexa 488 e Cy3 durante a aquisição de imagens com uma ampliação objetiva de 100X. Grave imagens com uma câmera e processe as imagens com o software de imagem apropriado.
