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1. Produção de 15N, 13C-Tau (Figura 1)
- Plasmídeo de expressão T7 recombinante ATransform pET15b-Tau em células bacterianas de Escherichia coli competentes para BL21(DE3).
NOTA: o cDNA que codifica a isoforma Tau mais longa (441 resíduos de aminoácidos) é clonada entre os locais de restrição NcoI e XhoI no plasmídeo pET15b.
- Misture suavemente 50 μl de células BL21(DE3) competentes, formando 1-5 x 107 colônias por μg de DNA de plasmídeo, com 100 ng de DNA de plasmídeo em um tubo de plástico de 1,5 ml.
nota: Cepas bacterianas otimizadas para uso de códons para expressão de cDNA eucariótico não são essenciais para produzir Tau humano.
- Coloque a mistura de células no gelo por 30 min e, em seguida, choque térmico por 10 segundos a 42 ° C. Coloque o tubo de volta no gelo por 5 min e adicione 1 ml de meio LB (Luria-Bertani) à temperatura ambiente. Incubar a suspensão bacteriana a 37 °C durante 30 min sob agitação suave.
- Espalhar uniformemente 100 μl de suspensão celular utilizando uma alça de inoculação sobre uma placa de ágar de meio LB contendo 100 μg/ml de antibiótico ampicilina.
- Incubar a placa de seleção durante 15 horas a 37 °C.
- Manter a placa de selecção a 4 °C até avançar para a fase de cultura, durante um máximo de 2 semanas aproximadamente.
NOTA: um estoque de glicerol de cultura bacteriana (glicerol a 50%), armazenado a -80 °C, pode ser preparado para iniciar a cultura em um estágio posterior.
- Adicione 1 ml de 1 M de MgSO4, 1 ml de 100 mM de CaCl2, 10 ml de complemento vitamínico 100x MEM, 1 ml de ampicilina 100 mg/ml a 1 L de sais M9 autoclavados (6 g de Na2HPO4, 3 g de KH2PO4, 0,5 g de NaCl).
nota: Um precipitado branco se formará com a adição da solução de CaCl2 aos sais M9 que se dissipa rapidamente.
- Solubilizar 300 mg de 15N, 13C-meio completo, 1 g de 15NH4Cl e 2 g de 13C6-glicose em 10 ml de meio M9. Filtre a solução isotópica usando um filtro de 0,2 μm, diretamente no meio M9.
- Suspender, com uma alça de inoculação, uma colónia de bactérias transformadas em pET15b-Tau da placa de selecção em 20 ml de meio LB suplementado com 100 μg/ml de ampicilina.
- Incubar o meio inoculado a 37 °C durante cerca de 6 horas.
- Medir a densidade óptica a 600 nm (OD600) em 1 ml de uma diluição de dez vezes da cultura bacteriana em uma cubeta de espectrômetro de plástico.
nota: A turbidez da cultura bacteriana correspondente ao OD600 de 3,0-4,0 indica que a fase de crescimento de saturação foi atingida.
- Adicionar 20 ml da cultura LB saturada a 1 L de meio de cultura M9 suplementado com ampicilina (concentração final de 100 μg/ml), num balão de cultura defletor de plástico Erlenmeyer de 2 L.
- Colocar o balão de cultura numa incubadora programável regulada para 10 °C e 50 rpm. Programe a incubadora para mudar para 200 RPM e 37 °C no início da manhã do dia seguinte.
- Medir OD600 em 1 ml de cultura bacteriana numa cubeta de espectrómetro de plástico. Adicionar 400 μl de solução-mãe 1 M IPTG (isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo) (mantida a -20 °C) quando OD600 atingir um valor de cerca de 1,0 para induzir a expressão da proteína Tau recombinante.
- Continue a incubação a 37 ° C por mais 3 horas. Colete as células bacterianas por centrifugação a 5.000 x g por 20 min.
- Congele o pellet bacteriano a -20 °C. Mantenha congelado até a etapa de purificação, por um longo período, se necessário.
2. Purificação de 15N, 13C-Tau (Figura 2)
- Tampões de purificação de troca catiônica em autoclave (CEX) a 121 °C abaixo de 15 psi por 20 min. Armazene os tampões a 4 °C.
- Descongele o pellet de células bacterianas e ressuspenda completamente em 45 ml de tampão CEX A de extração (tampão NaPi 50 mM pH 6,5, EDTA 1 mM) recém-suplementado com coquetel inibidor de protease 1x (1 comprimido) e DNAseI (2.000 unidades).
- Interrompa as células bacterianas usando um homogeneizador de alta pressão a 20.000 psi. São necessárias 3-4 passagens. Centrifugue a 20.000 x g por 40 min para remover o material insolúvel.
- Aquecer o extrato de células bacterianas por 15 min a 75 °C em banho-maria.
NOTA: um precipitado branco é observado após alguns minutos.
- Centrifugue a 15.000 x g por 20 min e mantenha o sobrenadante contendo a proteína Tau estável ao calor.
- Conservar a -20 °C até ao passo de purificação seguinte, se necessário.
- Efectuar a cromatografia permutadora catiónica numa resina CEX forte, embalada em coluna de leito de 5 ml, utilizando um sistema de cromatografia líquida rápida de proteínas (FPLC) (figura 3 A).
- Defina a taxa de fluxo para 2.5 ml/min.
- Equilibre a coluna no buffer CEX A
- Carregar o extracto aquecido de 60-70 ml contendo Tau utilizando uma bomba de amostra ou, em alternativa, bombear A, consoante o sistema. Colete o fluxo para análise para verificar se a proteína Tau está se ligando eficientemente à resina (ver 2.8).
- Lavar a resina com tampão CEX A até que a absorvância a 280 nm volte ao valor inicial.
- Eluir Tau da coluna usando um gradiente de NaCl de três etapas obtido por um aumento gradual do tampão CEX B (tampão CEX A com NaCl 1 M). Programe o FPLC da seguinte forma: a primeira etapa do gradiente para 25% de tampão CEX B em 10 volumes de coluna (CV) para atingir 250 mM de NaCl, a segunda etapa para 50% de tampão CEX B em 5 CV para atingir 500 mM de NaCl e a terceira etapa para 100% de tampão CEX B em 2 CV para atingir 1 M de NaCl. Coletar frações de 1,5 ml durante as etapas de eluição.
- Analise 10 μl das frações coletadas durante a etapa de eluição por SDS-PAGE (gel de SDS-acrilamida a 12%) e coloração de Coomassie (Figura 3 A). Verifique também a etapa de carregamento na coluna analisando 10 μl do fluxo.
- Escolha as frações que contêm Tau e agrupe essas frações para a próxima etapa.
- Realizar uma troca de buffer em frações agrupadas contendo Tau (Figura 3 B).
- Equilibre uma coluna de dessalinização de 53 ml de leito de resina G25 (26 x 10 cm) em bicarbonato de amônio 50 mM (tampão volátil) usando um sistema FPLC.
- Defina a taxa de fluxo para 5 ml/min. Injete a amostra de Tau na coluna por meio de um loop de injeção de 5 ml. Recolher as fracções correspondentes ao pico de absorção a 280 nm.
- Repita a injeção 3-4 vezes, dependendo do volume do pool CEX inicial.
- Calcular a quantidade de proteína Tau purificada utilizando a área do pico do cromatograma a 280 nm (1 mg de Tau corresponde a 140 mAU*ml).
nota: O coeficiente de extinção da proteína Tau a 280 nm é de 7.550 M-1 cm-1. Tau não contém resíduos de Trp.
- Agrupe todas as frações de Tau.
- Alíquota da amostra em tubos contendo o equivalente a 1 a 5 mg de Tau. Escolha esses tubos de forma que o volume da solução seja pequeno em comparação com o volume do tubo (por exemplo, 5 ml de solução em um tubo de 50 ml).
- Faça furos nas tampas dos tubos usando uma agulha. Congelar amostras de Tau a -80 °C.
- Liofiliza amostras de Tau. A proteína Tau liofilizada pode ser mantida a -20 °C por longos períodos de tempo.
3. Fosforilação in vitro de 15N-Tau
- Dissolva 5 mg de Tau liofilizado em tampão fosforilação de 500 μl (50 mM Hepes · KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl).
- Adicionar 2,5 mM de ATP (25 μl de solução-mãe 100 mM mantida a -20 °C), 1 mM de DTT (1 μl de solução-mãe 1 M mantida a -20 °C), 1 mM de EGTA (2 μl de uma solução-mãe 0,5 M), 1x coquetel de inibidor de protease (25 μl de um estoque de 40x obtido pela dissolução de 1 comprimido em 1 ml de tampão fosforilação) e 1 μM de His-ERK2 ativado (250 μl em tampão conservacionista 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl e 10% glicerol, armazenados a -80 °C) em um volume total de amostra de 1 ml.
nota: O His-ERK2 ativado pode ser preparado internamente por fosforilação com a quinase MEK.
- Incubar 3 horas a 37 °C.
- Aqueça a amostra a 75 °C por 15 min para inativar a quinase ERK.
- Centrifugue a 20.000 x g por 15 min. Colete e guarde o sobrenadante.
- Dessalinize a amostra de proteína em bicarbonato de amônio 50 mM usando uma coluna de 3,45 ml de leito cheio de resina G25 (1,3 x 2,6 cm), que é adequado para uma amostra de 1 ml.
- Execute um SDS-PAGE a 12% com 2,5 μl da amostra de proteína para verificar sua integridade e fosforilação eficiente (Figura 4).
- Liofilizar a amostra de Tau fosforilada. Conservar o pó a -20 °C.
4. Aquisição de espectros de RMN (Figura 5)
- Solubilizar 4 mg de Tau fosforilada de 15N, 13C ERK liofilizada em tampão RMN de 400 μl (50 mM de NaPi ou 50 mM de Tris-d11 deuterado. Cl, pH 6,5, NaCl 30 mM, EDTA 2,5 mM e DTT 1 mM).
- Adicionar 5% D2O para bloqueio de campo do espectrómetro de RMN e 1 mM TMSP [3-(trimetilsilil)propiónico-2,2,3,3-d4 sal de sódio ácido)] como referência de sinal de RMN interna. Adicione 10 μl de uma solução estoque 40x de um coquetel completo de inibidores de protease.
- Transfira a amostra para um tubo de RMN de 5 mm usando uma seringa eletrônica com uma agulha longa ou pipeta de Pasteur. Feche o tubo de RMN usando o êmbolo. Remova quaisquer bolhas de ar presas entre o êmbolo e o líquido por movimentos do êmbolo.
- Coloque o tubo de RMN em um spinner. Ajuste sua posição vertical no spinner com o medidor apropriado para o cabeçote da sonda de RMN usado, de modo que a maior parte da solução da amostra fique dentro da bobina de RMN.
- Inicie o fluxo de ar: clique em levantar na janela do sistema de controle magnético. Coloque cuidadosamente o spinner com o tubo no fluxo de ar na parte superior do orifício do ímã. Pare o fluxo de ar (clique em levantar) e deixe o tubo descer no lugar dentro da cabeça da sonda no ímã.
- Defina a temperatura para 25 °C (298 K).
- Execute o ajuste semiautomático e a correspondência do cabeçote da sonda para otimizar a transmissão de potência. Digite atmm na linha de comando.
- Bloqueie a frequência do espectrômetro usando o sinal D2O da amostra registrada no canal de deutério. Clique em cadeado na janela do sistema de controle magnético.
- Inicie o procedimento de calço para otimizar a homogeneidade do campo magnético na posição da amostra. Digite topshim gui na linha de comando para abrir a janela de correção. Clique em Iniciar na janela de correção. Verifique o valor de variação padrão residual B0 para verificar se os calços são ideais (menos de 2 Hz é bom).
- Calibrar o parâmetro p1 (comprimento de um pulso de radiofrequência de protões em μseg), que é necessário para obter uma rotação de 90° dos spins dos protões. Aponte para o pulso de 360 ° usando um espectro 1D de prótons de água (Figura 6).
- Ajuste o deslocamento de frequência definindo o parâmetro o1 (em Hz) para a frequência da água de prótons no espectro 1D (Figura 6).
- Inicie a aquisição de um espectro de prótons 1D (sequência de pulso com sequência de watergate para supressão de sinal de água, por exemplo, zggpw5) para verificar os sinais da amostra (Figura 7). Adapte o número de varreduras à concentração relativa de proteínas. Digite zg na linha de comando para iniciar a aquisição.
