1. Concentração de trabalho dos componentes da reação
- Preparar as concentrações de trabalho dos tampões para CD e mantê-las a 4 °C antes de estabelecer as reacções.
nota: Para as reações de CD descritas neste artigo, as concentrações de trabalho dos componentes são as seguintes: Tampão fosfato de sódio (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Proteína 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.
2. Escolha e preparação de cubetas de CD
- Colete espectros de CD em cubetas de quartzo de alta transparência. Use cubetas retangulares ou cilíndricas.
nota: Uma cubeta de quartzo CD (volume nominal de 0,4 mL, comprimento do trajeto de 1 mm) foi usada para todas as reações descritas neste trabalho.
- Use uma solução de limpeza de cuvete para limpar a cubeta. Adicione a solução de limpeza de cubeta a 1% em água para fazer 400 μL da solução, despeje na cubeta e incube a 37 ° C por 1 h.
- Lave a cubeta com água várias vezes para limpá-la. Faça uma varredura da água ou tampão na cubeta para verificar se está limpa.
nota: A água ou tampão deve fornecer uma leitura na faixa de 0 a 1 mdeg.
3. Preparação de proteínas e oligonucleotídeos de DNA
- Mantenha o volume da proteína abaixo de 50 μL na reação para minimizar as quantidades dos componentes tampão que às vezes causam a formação de picos ambíguos. Mantenha a proteína no gelo durante todo o experimento para evitar qualquer degradação.
- Utilizar oligonucleotídeos de DNA purificados por PAGE nas reações.
nota: Nas reações aqui descritas, o DNA foi usado tanto na forma nativa quanto na forma resfriada a quente (resfriamento rápido (FC) e resfriamento lento (SC)). O resfriamento rápido promove a ligação intramolecular no DNA, produzindo mais estruturas secundárias. Em contraste, o resfriamento lento promove a ligação intermolecular no DNA, resultando em menos estruturas secundárias.
- Para um resfriamento rápido, aqueça o DNA a 94 °C por 3 min no bloco de aquecimento e resfrie-o imediatamente no gelo. Para arrefecimento lento, aquecer o ADN a 94 °C durante 3 min e deixá-lo arrefecer até à temperatura ambiente a uma taxa de 1 °C por minuto.
4. Configurando experimentos de controle para registrar os espectros da linha de base
- Mantenha o volume de reação em 300 μL em todas as reações. Configure um total de 5 reações basais em tubos de centrífuga de 1,5 mL, uma a uma, da seguinte forma: i) Tampão + Água; ii) Tampão + MgCl2 + ATP + Água; iii) Tampão + MgCl2 + ATP + Proteína + Água; iv) iii + EDTA ou ADAADiN; v) Tampão + Proteína + Água.
5. Configurando os experimentos para gravar espectros de CD
- Configure um total de 5 reações, uma a uma, em tubos de centrífuga de 1,5 mL da seguinte forma: i) Tampão + DNA + Água; ii) Tampão + DNA + MgCl2 + ATP + Água; iii) Tampão + DNA + MgCl2 + ATP + Proteína + Água; iv) iii + EDTA ou ADAADiN; v) Tampão + DNA + Proteína + Água.
6. Gravação de digitalização
- Ligue o gás e ligue o espectrômetro de CD.
- Ligue a lâmpada após 10-15 min. Ligue o banho-maria e ajuste a temperatura do suporte para 37 °C.
- Abra o software de espectro de CD.
- Defina a temperatura para 37 °C.
- Defina a faixa de comprimento de onda em 180 - 300 nm.
- Defina o tempo por ponto para 0.5 s.
- Defina o número de digitalização como 5.
- Clique em Pro-Data Viewer, crie um novo arquivo e renomeie-o com detalhes sobre o experimento e a data.
- Mantenha todos os componentes da reação no gelo para evitar qualquer degradação. Faça as linhas de base e reações, uma a uma, em tubos de centrífuga e misture-os por pipetagem. Transfira a mistura de reação para a cubeta com cuidado, certificando-se de que não haja bolhas de ar.
- Se estiver realizando um experimento de curso de tempo, incube as reações a 37 ° C pelo tempo necessário e faça a varredura. Adicione EDTA ao tampão contendo DNA, ATP, Mg + 2 e proteína para interromper a hidrólise do ATP.
- Aumente a concentração de EDTA e seu tempo de incubação para inibir completamente a atividade da ATPase.
- Subtraia as linhas de base das reações correspondentes no software (por exemplo, subtraia a reação 1 da linha de base 1). Suavize os dados no software de espectro de CD ou no software de plotagem de dados. Plote os dados no software de plotagem de dados.
nota: Subtraindo as linhas de base das reações correspondentes, obteremos os espectros de CD líquido apenas de DNA.
7. Análise e interpretação dos dados
- Use a fórmula dada pela eq (1) para converter os valores obtidos em miligraus para a elipticidade média do resíduo.
Aqui, S é o sinal de CD em miligraus, c é a concentração de DNA em mg/mL, mRw é a massa média do resíduo e l é o comprimento do caminho em cm.
- Plote um gráfico em relação ao comprimento de onda e à elipticidade média do resíduo usando o software de plotagem de dados e analise os picos.
- Para plotar o gráfico, selecione a elipticidade média do resíduo no eixo Y e o comprimento de onda no eixo X e plote um gráfico em linha reta.
nota: Este gráfico fornecerá os picos característicos de diferentes formas de DNA. As formas de DNA correspondentes aos picos podem ser identificadas usando a literatura existente.