Um imunoensaio direto baseado em espectroscopia Raman para detectar um antígeno específico

Resumo

Fonte: Hanson, C., et al. Fabricando uma plataforma de imunoensaio de espectroscopia UV-Vis e Raman. J. Vis.(2016).

Neste vídeo, descrevemos o método de imunoensaio direto baseado em espectroscopia Raman para detectar antígenos-alvo específicos. Os anticorpos, que são adsorvidos na superfície das nanopartículas de ouro ligadas às sondas Raman, interagem com os antígenos-alvo e produzem um espectro Raman específico, que é posteriormente detectado.

Protocolo

1. Prepare as sondas UV-Vis/Raman

1. Prepare a solução AuNP nua
   1. Preparar uma solução de 2 ml de AuNPs com uma concentração de aproximadamente 1 x 1011 partículas por ml.
      1. Se as AuNPs precisarem ser concentradas, encha os tubos de centrífuga de baixa ligação com 2.000 μl de AuNP estoque e centrifugue a 5.000 x g por 20 min ou até que o sobrenadante esteja limpo. Remova o sobrenadante pipetando, tomando cuidado para não perturbar o pellet AuNP.
      2. Combine as soluções de AuNP restantes em um tubo e estime a concentração obtendo uma medição UV-Vis e comparando os valores com as concentrações conhecidas, pois esta é uma relação linear.
2. Determine a proporção apropriada de rotulagem do repórter Raman
   1. Prepare uma solução de trabalho do repórter Raman dissolvido em metanol. Essa concentração dependerá do repórter usado. Neste trabalho, preparar o iodeto de 3,3′-dietiltiatricarbocianina (DTTC) numa solução de trabalho de 200 μM.
   2. Assumindo um volume final de 100 μl para cada poço, adicione uma quantidade suficiente da solução repórter de trabalho a cada poço da primeira fileira de uma placa de 96 poços, de modo que o repórter Raman varie em concentrações de 0,2 μM a 10 μM. Adicione água suficiente de grau HPLC a cada poço, de modo que o volume seja de 80 μl. Adicione 20 μl de AuNP a cada poço, formando um volume final de 100 μl para cada poço. Um exemplo é fornecido na Tabela 1.
   3. Medir os espectros UV-Vis de 400 a 700 nm utilizando um espectrofotómetro UV-Vis de leitura de placas. A concentração apropriada é a concentração mais alta com picos definidos para os espectros UV-Vis. Repita a etapa 2.2.2 em concentrações crescentes até que a maior proporção de concentração de repórteres Raman para AuNPs seja encontrada.
      nota: O corante e a forma, tamanho e fabricante do AuNP influenciam a concentração apropriada. Portanto, as etapas listadas devem ser avaliadas e alteradas dependendo dos componentes utilizados. Este protocolo envolveu o uso de um corante carregado positivamente. Como tal, a ligação entre o AuNP e o repórter foi melhorada usando AuNPs carregados negativamente. Isso foi feito usando AuNPs com limite de citrato. Consulte a seção Discussão para obter mais detalhes.
3. Vinculando o repórter Raman e o PEG-Ab ao AuNP
   1. Prepare dois lotes de 1,5 ml de AuNP e Raman repórter na concentração previamente determinada, permitindo que o repórter Raman se ligue às AuNPs por 30 min à temperatura ambiente.
   2. Adicione o anticorpo PEGulado (PEG-Ab) a um lote da solução repórter AuNP e Raman para criar uma proporção de 200:1 de anticorpos para partículas. Esta solução será para as amostras de teste. Em um tubo de microcentrífuga separado, adicione o antígeno PEGulado ao outro lote da solução repórter AuNP e Raman a uma proporção de 200: 1 de anticorpos para partículas a serem usadas como controle. Incubar as soluções por 30 min em temperatura ambiente.
      NOTA: A proporção de anticorpos para partículas será específica para os AuNPs e corantes usados e deve ser otimizada para cada caso individual. O objetivo aqui é ter a maior proporção de anticorpos para as sondas AuNP se ligarem, evitando a agregação das partículas. Use a seguinte equação para determinar os volumes apropriados a serem somados:
      
      em que V é o volume e C é a concentração expressa em partículas ou anticorpos por ml. O volume final deve ser de aproximadamente 1,5 ml.
4. Bloqueie os locais restantes na superfície AuNP com mPEG-SH.
   1. Preparar o mPEG-SH dissolvendo o metoxipolietilenoglicol tiol sólido até uma concentração de 200 μM com água. Vortex a solução até que o mPEG-SH esteja completamente dissolvido.
   2. Adicione mPEG-SH em uma proporção de 40.000:1 à solução AuNP-PEG-Ab feita na etapa 2.3. Incube a solução em temperatura ambiente por 10 min para garantir que os locais restantes na nanopartícula de ouro sejam bloqueados. Use a seguinte equação para determinar os volumes apropriados a serem somados:
      
      em que V é o volume e C é a concentração expressa em partículas ou anticorpos por ml. O volume final deve ser de aproximadamente 1,5 ml.
5. Recupere sondas Raman funcionalizadas.
   1. Centrifugue as partículas a 5.000 x g por 20 min em tubos de centrífuga de baixa ligação ou até que o sobrenadante esteja claro. Remova o sobrenadante pipetando, tomando cuidado para não perturbar os AuNPs.
   2. Ressuspenda as partículas com 1 ml de 1x solução de PBS que foi feita anteriormente. Estime a concentração de AuNP fazendo uma medição UV-Vis de um pequeno volume de solução (3 μl) e compare os resultados com as medições de uma concentração de AuNP conhecida. Ajustar o volume de modo a que a solução final seja de, pelo menos, 1 x 10¹¹ partículas por ml.
   3. Conservar as soluções a 4 °C até serem utilizadas para a funcionalização da placa de imunoensaio. Use as soluções dentro de uma semana.

Tabela 1. Exemplo de diluição DTTC. Várias diluições de DTTC e os volumes associados de estoque DTTC, solução de nanopartículas de ouro e água.

	Volumes a serem adicionados de cada componente (ml)
Concentração final de DTTC (mM)	Solução de trabalho DTTC (200 mM)	AuNP	Água
0,2	0,1	20	79,9
0,6	0,3	20	79,7
1	0,5	20	79,5
algarismo	1.0	20	79
5	2.5	20	77,5
7	3.5	20	76,5
10	5.0	20	75

2. Preparação da placa de imunoensaio

1. Ligar o antigénio desejado à placa de imunoensaio.
   1. Preparar antigénios diluídos (50 μg/ml) suficientes para encher os alvéolos de poliestireno. Vortex a solução e adicione imediatamente a solução aos poços das placas. Deixe o antígeno se ligar às placas por 1 hora à temperatura ambiente.
2. Lave os antígenos não ligados.
   1. Remova o excesso de solução de antígeno despejando a solução em um recipiente de descarte e batendo o prato contra uma mesa coberta com papel toalha.
   2. Adicione TBST aos poços para lavar a superfície e, em seguida, remova a lavagem da mesma maneira indicada anteriormente. Repita esta etapa mais duas vezes.
3. Bloqueie os locais de ligação restantes na placa para evitar ligações não específicas.
   1. Adicione 70 μl de solução de bloqueio de HSA a cada poço da placa e incube à temperatura ambiente por 30 min.
   2. Remova e enxágue a placa usando o mesmo procedimento especificado na etapa 3.2. Cubra a placa e guarde-a seca a 4 °C até que esteja pronto para uso posterior.
4. Funcionalize a placa de imunoensaio.
   1. Adicione 70 μl das nanopartículas da sonda preparadas na Seção 2 à primeira coluna de uma placa de 96 poços e dilua as colunas subsequentes usando uma diluição serial de 1:2. Deixe a placa incubar por pelo menos 1 hora. Um exemplo de como preparar a placa de imunoensaio é dado na Figura 1.
   2. Lave a placa com TBST cinco vezes conforme detalhado na etapa 3.2, certificando-se de descartar os AuNPs adequadamente. Após a lavagem final, adicione 70 μl de 1x PBS a cada poço e cubra com uma vedação de placa.
      NOTA: As amostras de controle devem ser claras. Se a ligação não específica tiver ocorrido, as amostras de controle terão uma cor semelhante às amostras de teste.
5. Teste a sensibilidade do ensaio por espectroscopia UV-Vis e Raman.
   1. Para cada alvéolo, medir os espectros UV-Vis que variam entre 400 e 700 nm, utilizando um espectrofotómetro UV-Vis de leitura de placas.
   2. Usando um microscópio Raman invertido, focalize a objetiva na superfície do poço que possui as sondas AuNP. Obtenha espectros Raman do poço. Colete um espectro variando de 1.800 ^cm-1 a 400 ^cm-1. Repita esta etapa para todos os poços.
   3. Usando o software espectral apropriado, execute uma correção de linha de base polinomial de 11ª ordem para os espectros Raman e um polinômio de^3ª ordem para os espectros UV-Vis.
   4. Usando o software espectral apropriado, normalize os espectros Raman e UV-Vis. Defina o valor máximo como 1 e dimensione todos os outros valores de acordo. Para normalizar os espectros Raman, selecione um pico de poliestireno exclusivo e defina-o igual a 1 e dimensione todos os outros valores de acordo.
   5. Usando o software espectral apropriado, execute a integração de pico para cada espectro. Para espectros Raman, o pico que representa o repórter Raman deve estar em uma região ausente de picos de poliestireno. Para realizar a integração de pico, especifique os limites integrais para o pico desejado e registre a área de pico desejada para todas as amostras, incluindo os controles.
   6. Plote a área média de pico de interesse em função do log da concentração AuNP com barras de erro para cada ponto indicando seu desvio padrão associado. Ajuste esses pontos de calibração a uma curva logística de 4 parâmetros.
   7. Determine o valor médio do branco calculando a média da área do pico de interesse para uma amostra em branco. Determine o desvio padrão dessas áreas; Este é o desvio padrão do espaço em branco.
   8. Para o mesmo pico analisado na etapa anterior, encontre o desvio padrão dessa área de pico para a menor concentração.
   9. Calcule o limite do branco e o limite inferior de detecção, conforme especificado na seção Resultados representativos. Use esses valores com as curvas de calibração 4PL para determinar o LLOD em termos de concentração de AuNP.

Resultados

Figura 1. Placa de imunoensaio preparada. Imagem de uma placa de imunoensaio preparada. As linhas A a E são amostras de teste, enquanto as linhas F a H são amostras de controle. A coluna 1 contém as nanopartículas não diluídas e cada coluna subsequente tem metade da concentração de sondas AuNP.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nanopartícula de ouro de 60 nm	Ted Pella, Inc.	15708-6	Estas são nanopartículas de ouro com tampa de citrato. Por favor, veja a discussão para a relação entre o repórter Raman e a carga de superfície AuNP e sua importância para a seleção adequada do repórter AuNP e / ou Raman.
bicarbonato de sódio	Fisher Científico	S233-500
metanol	Pharmco-Aaper	Rolamento 339000000
Solução salina tamponada com tris (10x) pH 7,5	Scy Tek	TBD999
Unidade de filtragem superior de garrafa	VWR	Rolamento 97066-202
Tween 20 (polissorbato 20)	Scy Tek	TWN500	Usado como agente emulsificante para etapas de lavagem.
Solução salina tamponada com fosfato 10x concentrado, pH 7,4	Scy Tek	Rolamento PBD999
Tubo LoBind de Proteína 2,0 ml	Tubos Eppendorf	22431102	Os tubos LoBind evitam a ligação de proteínas e AuNPs às superfícies dos tubos.
Tubo LoBind de Proteína 0,5 ml	Tubos Eppendorf	22431064	Os tubos LoBind evitam a ligação de proteínas e AuNPs às superfícies dos tubos.
Dispositivos de microplacas UniSeal	GE Saúde	7704-0001	Utilizado para selar e armazenar placas funcionalizadas.
Placa de ensaio, com tampa de baixa evaporação, fundo plano de 96 poços	Costar	3370
Água para HPLC	Sigma Aldrich	270733-4L
Iodeto de 3,3′-dietiltiatricarbocianina (DTTC)	Sigma Aldrich	381306-250MG	Repórter Raman
mPEG-Tiol, MW 5.000 - 1 grama	Laysan Bio, Inc.	MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA, MW 5.000 - 1 grama	Laysan Bio, Inc.	OPSS-PEG-SVA-5000-1g	OPSS-PEG-SVA tem um fim do NHS.
IgG de camundongo, controle de molécula inteira	Thermo Fisher Científico	Rolamento 31903	antígeno
Anticorpo secundário adsorvido cruzado anti-IgG (H+L) de cabra anti-camundongo	Thermo Fisher Científico	Rolamento 31164	anticorpo
Solução de bloqueio de albumina sérica humana	Sigma Aldrich	A1887-1G	Albumina de soro bovino pode ser usada em seu lugar.
Espectrofotômetro UV-Vis	Thermo Científico	Nanodrop 2000c
Espectrofotômetro UV-Vis	BioTek	Sinergia 2
Unidade de microscópio Raman invertido de 785 nm construída internamente	N/A	N/A	Um microscópio Raman invertido é melhor para focar adequadamente na superfície da placa do poço. Caso contrário, uma ampliação muito baixa será usada devido à altura da placa de 96 poços. Um sistema construído internamente foi usado, pois era mais barato do que comprar de um fornecedor. No entanto, qualquer sistema de microscópio Raman invertido disponível comercialmente pode ser usado.