1. Prepare as sondas UV-Vis/Raman
- Prepare a solução AuNP nua
- Preparar uma solução de 2 ml de AuNPs com uma concentração de aproximadamente 1 x 1011 partículas por ml.
- Se as AuNPs precisarem ser concentradas, encha os tubos de centrífuga de baixa ligação com 2.000 μl de AuNP estoque e centrifugue a 5.000 x g por 20 min ou até que o sobrenadante esteja limpo. Remova o sobrenadante pipetando, tomando cuidado para não perturbar o pellet AuNP.
- Combine as soluções de AuNP restantes em um tubo e estime a concentração obtendo uma medição UV-Vis e comparando os valores com as concentrações conhecidas, pois esta é uma relação linear.
- Determine a proporção apropriada de rotulagem do repórter Raman
- Prepare uma solução de trabalho do repórter Raman dissolvido em metanol. Essa concentração dependerá do repórter usado. Neste trabalho, preparar o iodeto de 3,3′-dietiltiatricarbocianina (DTTC) numa solução de trabalho de 200 μM.
- Assumindo um volume final de 100 μl para cada poço, adicione uma quantidade suficiente da solução repórter de trabalho a cada poço da primeira fileira de uma placa de 96 poços, de modo que o repórter Raman varie em concentrações de 0,2 μM a 10 μM. Adicione água suficiente de grau HPLC a cada poço, de modo que o volume seja de 80 μl. Adicione 20 μl de AuNP a cada poço, formando um volume final de 100 μl para cada poço. Um exemplo é fornecido na Tabela 1.
- Medir os espectros UV-Vis de 400 a 700 nm utilizando um espectrofotómetro UV-Vis de leitura de placas. A concentração apropriada é a concentração mais alta com picos definidos para os espectros UV-Vis. Repita a etapa 2.2.2 em concentrações crescentes até que a maior proporção de concentração de repórteres Raman para AuNPs seja encontrada.
nota: O corante e a forma, tamanho e fabricante do AuNP influenciam a concentração apropriada. Portanto, as etapas listadas devem ser avaliadas e alteradas dependendo dos componentes utilizados. Este protocolo envolveu o uso de um corante carregado positivamente. Como tal, a ligação entre o AuNP e o repórter foi melhorada usando AuNPs carregados negativamente. Isso foi feito usando AuNPs com limite de citrato. Consulte a seção Discussão para obter mais detalhes.
- Vinculando o repórter Raman e o PEG-Ab ao AuNP
- Prepare dois lotes de 1,5 ml de AuNP e Raman repórter na concentração previamente determinada, permitindo que o repórter Raman se ligue às AuNPs por 30 min à temperatura ambiente.
- Adicione o anticorpo PEGulado (PEG-Ab) a um lote da solução repórter AuNP e Raman para criar uma proporção de 200:1 de anticorpos para partículas. Esta solução será para as amostras de teste. Em um tubo de microcentrífuga separado, adicione o antígeno PEGulado ao outro lote da solução repórter AuNP e Raman a uma proporção de 200: 1 de anticorpos para partículas a serem usadas como controle. Incubar as soluções por 30 min em temperatura ambiente.
NOTA: A proporção de anticorpos para partículas será específica para os AuNPs e corantes usados e deve ser otimizada para cada caso individual. O objetivo aqui é ter a maior proporção de anticorpos para as sondas AuNP se ligarem, evitando a agregação das partículas. Use a seguinte equação para determinar os volumes apropriados a serem somados:
em que V é o volume e C é a concentração expressa em partículas ou anticorpos por ml. O volume final deve ser de aproximadamente 1,5 ml.
- Bloqueie os locais restantes na superfície AuNP com mPEG-SH.
- Preparar o mPEG-SH dissolvendo o metoxipolietilenoglicol tiol sólido até uma concentração de 200 μM com água. Vortex a solução até que o mPEG-SH esteja completamente dissolvido.
- Adicione mPEG-SH em uma proporção de 40.000:1 à solução AuNP-PEG-Ab feita na etapa 2.3. Incube a solução em temperatura ambiente por 10 min para garantir que os locais restantes na nanopartícula de ouro sejam bloqueados. Use a seguinte equação para determinar os volumes apropriados a serem somados:
em que V é o volume e C é a concentração expressa em partículas ou anticorpos por ml. O volume final deve ser de aproximadamente 1,5 ml.
- Recupere sondas Raman funcionalizadas.
- Centrifugue as partículas a 5.000 x g por 20 min em tubos de centrífuga de baixa ligação ou até que o sobrenadante esteja claro. Remova o sobrenadante pipetando, tomando cuidado para não perturbar os AuNPs.
- Ressuspenda as partículas com 1 ml de 1x solução de PBS que foi feita anteriormente. Estime a concentração de AuNP fazendo uma medição UV-Vis de um pequeno volume de solução (3 μl) e compare os resultados com as medições de uma concentração de AuNP conhecida. Ajustar o volume de modo a que a solução final seja de, pelo menos, 1 x 1011 partículas por ml.
- Conservar as soluções a 4 °C até serem utilizadas para a funcionalização da placa de imunoensaio. Use as soluções dentro de uma semana.
Tabela 1. Exemplo de diluição DTTC. Várias diluições de DTTC e os volumes associados de estoque DTTC, solução de nanopartículas de ouro e água.
| Volumes a serem adicionados de cada componente (ml) |
| Concentração final de DTTC (mM) | Solução de trabalho DTTC (200 mM) | AuNP | Água |
| 0,2 | 0,1 | 20 | 79,9 |
| 0,6 | 0,3 | 20 | 79,7 |
| 1 | 0,5 | 20 | 79,5 |
| algarismo | 1.0 | 20 | 79 |
| 5 | 2.5 | 20 | 77,5 |
| 7 | 3.5 | 20 | 76,5 |
| 10 | 5.0 | 20 | 75 |
2. Preparação da placa de imunoensaio
- Ligar o antigénio desejado à placa de imunoensaio.
- Preparar antigénios diluídos (50 μg/ml) suficientes para encher os alvéolos de poliestireno. Vortex a solução e adicione imediatamente a solução aos poços das placas. Deixe o antígeno se ligar às placas por 1 hora à temperatura ambiente.
- Lave os antígenos não ligados.
- Remova o excesso de solução de antígeno despejando a solução em um recipiente de descarte e batendo o prato contra uma mesa coberta com papel toalha.
- Adicione TBST aos poços para lavar a superfície e, em seguida, remova a lavagem da mesma maneira indicada anteriormente. Repita esta etapa mais duas vezes.
- Bloqueie os locais de ligação restantes na placa para evitar ligações não específicas.
- Adicione 70 μl de solução de bloqueio de HSA a cada poço da placa e incube à temperatura ambiente por 30 min.
- Remova e enxágue a placa usando o mesmo procedimento especificado na etapa 3.2. Cubra a placa e guarde-a seca a 4 °C até que esteja pronto para uso posterior.
- Funcionalize a placa de imunoensaio.
- Adicione 70 μl das nanopartículas da sonda preparadas na Seção 2 à primeira coluna de uma placa de 96 poços e dilua as colunas subsequentes usando uma diluição serial de 1:2. Deixe a placa incubar por pelo menos 1 hora. Um exemplo de como preparar a placa de imunoensaio é dado na Figura 1.
- Lave a placa com TBST cinco vezes conforme detalhado na etapa 3.2, certificando-se de descartar os AuNPs adequadamente. Após a lavagem final, adicione 70 μl de 1x PBS a cada poço e cubra com uma vedação de placa.
NOTA: As amostras de controle devem ser claras. Se a ligação não específica tiver ocorrido, as amostras de controle terão uma cor semelhante às amostras de teste.
- Teste a sensibilidade do ensaio por espectroscopia UV-Vis e Raman.
- Para cada alvéolo, medir os espectros UV-Vis que variam entre 400 e 700 nm, utilizando um espectrofotómetro UV-Vis de leitura de placas.
- Usando um microscópio Raman invertido, focalize a objetiva na superfície do poço que possui as sondas AuNP. Obtenha espectros Raman do poço. Colete um espectro variando de 1.800 cm-1 a 400 cm-1. Repita esta etapa para todos os poços.
- Usando o software espectral apropriado, execute uma correção de linha de base polinomial de 11ª ordem para os espectros Raman e um polinômio de3ª ordem para os espectros UV-Vis.
- Usando o software espectral apropriado, normalize os espectros Raman e UV-Vis. Defina o valor máximo como 1 e dimensione todos os outros valores de acordo. Para normalizar os espectros Raman, selecione um pico de poliestireno exclusivo e defina-o igual a 1 e dimensione todos os outros valores de acordo.
- Usando o software espectral apropriado, execute a integração de pico para cada espectro. Para espectros Raman, o pico que representa o repórter Raman deve estar em uma região ausente de picos de poliestireno. Para realizar a integração de pico, especifique os limites integrais para o pico desejado e registre a área de pico desejada para todas as amostras, incluindo os controles.
- Plote a área média de pico de interesse em função do log da concentração AuNP com barras de erro para cada ponto indicando seu desvio padrão associado. Ajuste esses pontos de calibração a uma curva logística de 4 parâmetros.
- Determine o valor médio do branco calculando a média da área do pico de interesse para uma amostra em branco. Determine o desvio padrão dessas áreas; Este é o desvio padrão do espaço em branco.
- Para o mesmo pico analisado na etapa anterior, encontre o desvio padrão dessa área de pico para a menor concentração.
- Calcule o limite do branco e o limite inferior de detecção, conforme especificado na seção Resultados representativos. Use esses valores com as curvas de calibração 4PL para determinar o LLOD em termos de concentração de AuNP.
