Artigo de método
Adulto normal tecido vascularizado mamíferos que carece de angiogênese fisiológica e que não tenha sido exposto a uma intervenção cirúrgica é usado para estudar: (i) o início e desenvolvimento da angiogênese após a administração intraperitoneal de agentes de teste, e (ii) a modificação da angiogênese após a administração sistêmica de selecionados agentes de teste.
O adulto de ratos mesentério ensaio angiogênese janela é biologicamente apropriada e é excepcionalmente adequado para o estudo de germinação angiogênese in vivo [ver artigos de revisão], que é a forma dominante de angiogênese em tumores humanos e não-tecidos tumorais, como discutido na revisão solicitada papers 1,2. Angiogênese induzida nas partes membranosas mesentérica por injeção intraperitoneal (ip) de um fator pró-angiogênico pode ser modulada por via subcutânea (sc), intravenosa (iv) ou oral (po) o tratamento com agentes modificadores de escolha. Cada parte membranosa do mesentério é translúcido e emoldurado por tecido adiposo, dando-lhe uma aparência janela-like.
O ensaio tem as seguintes características vantajosas: (i) o tecido de teste é nativamente vascularizado, apesar da baixa densidade, e uma vez que é extremamente fina, a rede microvascular é praticamente bidimensional, que permite que toda a rede a ser avaliados microscopicamente in situ; ( ii) em ratos adultos o tecido teste carece de angiogênese fisiológica significativa, o que caracteriza a maioria dos adultos normais tecidos de mamíferos, o grau de vascularização nativa é, no entanto, correlacionada com a idade, como discutido no 1; (iii) o nível insignificante de trauma angiogênese induzida garante alta sensibilidade; (iv) o ensaio reproduz a situação clínica, como as drogas angiogênese modulador de teste são administrados por via sistémica e as respostas observadas refletem o efeito líquido de todos os metabólica, celular e alterações moleculares induzidas pelo tratamento, (v) o ensaio permite avaliações de objetivo, quantitativo, variáveis imparciais sobre extensão espacial microvascular, densidade e formação de padrões de rede, bem como de germinação capilar, permitindo assim robusta análises estatísticas da dose-efeito e molecular relações estrutura-actividade, e (vi ) o ensaio revela com alta sensibilidade aos efeitos tóxicos ou nocivos dos tratamentos em termos de diminuição da taxa de ganho de peso-fisiológicos, como ratos adultos crescer robustamente.
Mast-mediada por células angiogênese foi demonstrada pela primeira vez com este ensaio 3,4. O modelo demonstra um alto nível de discriminação em relação dose-efeito e os efeitos medidos administrada sistemicamente quimicamente ou funcionalmente drogas intimamente relacionados e proteínas, incluindo: (i) de baixa dosagem, administrada metronomicamente quimioterápicos padrão que produzem diversos, drogas efeitos específicos (isto é, atividades angiogênese-supressiva, neutro ou angiogênese estimulante 5), (ii) natural de ferro-insaturados lactoferrina humana, o que estimula VEGF-A-angiogênese mediada 6, e natural de ferro-insaturados lactoferrina bovina, que inibe o VEGF-A- angiogênese mediada 7, e (iii) as frações de baixo peso molecular, a heparina produzida por vários meios 8,9. Além disso, o ensaio é altamente adequado para estudos dos efeitos combinados sobre a angiogênese de agentes que são administrados por via sistémica, de forma concomitante ou seqüencial.
A idéia de fazer este vídeo originou-se do falecido Dr. Judah Folkman, quando visitou nosso laboratório e testemunhou a metodologia que está sendo demonstrada.
Revisão papers (convidados) discutindo e avaliando o ensaio
Norrby, K. Em modelos in vivo da angiogênese. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. O teste de drogas com modelos de angiogênese. Especialista Opin. Drogas. Descoberta. 3, 533-549 (2008).
1. Animais
Nós trabalhamos em uma instituição de cuidados de alto padrão animal e esforços consideráveis são feitos para minimizar os níveis de estresse vivida pelos animais. As diretrizes atuais éticos são aqueles estabelecidos pela Workman P. et al. (Diretrizes para o bem-estar e uso de animais na pesquisa do câncer. Br. J. Cancer 102, 1555-1577, 2010). O Animal Comitê de Ética da Universidade de Gotemburgo aprovou esses estudos.
2. Pró-angiogênicos tratamento intraperitoneal
3. Administrando sistêmico da angiogênese modulador agentes
4. Acabar com o Experimento
5. Amostras de tecido colheita
Deve-se mencionar que a vasculatura de tecido e de patentes podem ser visualizadas antes da colheita com microscopia de luz transmitida intravital.
6. Protocolo para a coloração imuno-histoquímica de microvasos
7. Imagem e Avaliação da Rede Microvascular em cada amostra Janela mesentérica após coloração imuno-histoquímica de células endoteliais vasculares
Como mostrado no filme, microvasos são microscopicamente visualizadas in situ no tecido intacto.
8. Análise estatística
Normalmente, usamos o padrão não-paramétrico Mann-Whitney U-teste para analisar unpaired (bicaudal) observações. Uma média de quatro janelas mesentérica por animal é usado como o ponto de dados independentes para cada variável da janela mesentérica. O critério de significância estatística é P ≤ 0,05.
O ensaio foi introduzida em 1986 3 e tem sido sucessivamente desenvolvidos e aperfeiçoados em nosso laboratório 7,10-12. Como discutido em artigos de revisão (convidado) 1, 2, o ensaio compara bem com outros mamíferos ensaio in vivo de angiogênese em consideração, nomeadamente, características importantes, como o tecido teste adultos é nativamente vascularizado e carece de angiogênese fisiológica; trauma mínimo, se houver, é infligida ao tecido; variáveis quantitativas realmente são medidos, o que permite análise estatística de som em relação dose-resposta e atividade molecular estudos; angiogênese surgimento ocorre, que é predominante em tecidos normais e tumores, e dados de toxicidade são facilmente acumulada em ratos que crescer robustamente fisiologicamente na idade adulta. Características desfavoráveis podem incluir o fato de que o ensaio é relativamente demorado, especialmente quando se avalia o número ea duração de segmentos individuais microvascular microvascular e brotos, que não permite observações real-time/serial, e que dificilmente é adequado para ratos uma vez que muitas janelas mesentérica em ratos falta microvasos pai potencial a partir do qual pode originar novos capilares.
Observações em tempo real, no entanto, habilitado por microscopia intravital onde as janelas exteriorizado, mas ainda intacta mesentérica estão espalhados ao longo de um estágio do microscópio enquanto o animal é anestesiado, como discutido na 1.
Avanços significativos na pesquisa da angiogênese foram alcançados nas últimas décadas com modelos como o micropocket da córnea, membrana pinto corioalantóicas e ensaios plug-sc Matrigel, que são ferramentas úteis, mas, em última análise limitada. Futuras aplicações clínicas de terapias anti-angiogênicos e pró-angiogênico exigir o estabelecimento e validação de mais sensível e biologicamente relevantes, verdadeiramente quantitativa modelos pré-clínicos, como o descrito no relatório atual.
Apoio financeiro para a maioria dos estudos foi fornecido pelo sueco Medical Research Council (concessão 5942).
Tampões e reagentes
0,5 M solução estoque Tris-HCl (pH 7,8)
Tris (hidroximetil) aminomethan (60,57 g) é dissolvido em ~ 900 ml água destilada e ~ 45 ml de HCl 25% (concentrado) é adicionado para atingir pH 7,8, seguido de diluição para 1 litro com água destilada.
Tris-buffer salina (TBS, pH 7.8)
A 200 ml da solução-mãe é adicionado 18 g NaCl dissolvido em ~ 1800 ml água destilada com ajuste de pH para 7,8 usando solução-mãe, seguido de diluição de 2 litros com água destilada.
TBS (pH 7,4)
A 200 ml da solução-mãe é adicionado 18 g de NaCl dissolvidos em dissolvido em ~ 1800 ml água destilada com ajuste de pH para 7,4 usando solução-mãe, seguido de diluição de 2 litros com água destilada.
Solução de tripsina (0,05% de tripsina, 0,1% CaCl 2)
Contém 0,1 g e 0,2 g de tripsina CaCl 2 em 200 ml TBS (pH 7,8).
Solução de sacarose 2,5%
Contém 5 g de sacarose em 200 ml TBS (pH 7,8).
Solução estoque de azida de sódio 1% em TBS (pH 7,4)
Contém 1 g Na-azida em 100 ml com TBS (pH 7,4).
Diluindo buffer: 0,1% BSA, 0,01% Na-azida
(Usado para diluir os anticorpos no ABC Vectastain kit). Contém 0,1 g de albumina bovina sérica (BSA) e 1 ml de 1% Na-azida, diluído para 100 ml com TBS (pH 7,4).
ABC kit Vectastain PK 4002, peroxidase ABC rato IgG
Soro de cavalo normal; bloqueio soro; solução amarela: 3 drops/10 ml de tampão de diluição.
Anticorpo biotinilado; anti-mouse IgG; solução de azul: um tampão de diluição drop/10 ml.
ABC reagentes: solução de laranja, 2 gotas mais marrom solução de 2 ml drops/10 TBS (pH 7,4).
Misture as soluções 20 minutos antes de usar!
Mouse (monoclonal) endotélio anti-rato (Biosource International, Camarillo, CA, EUA)
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Catalogo | ARU0181 | ||
| Clone # | OX MRC-43 |
Este anticorpo é dirigido contra todas as células do endotélio vascular em ratos, com exceção dos que estão no cérebro.
Peroxidase Vectastain Avidin Biotina Complexo (ABC) kit
O kit contém o anticorpo primário, o anticorpo secundário biotinilado, avidina-biotinilado complexo enzimático (ABC), e do substrato da enzima. Ver www.vectorlabs.com ou www.immunkemi.se para protocolos.
Albumina sérica bovina (BSA) (catálogo da Sigma-Aldrich, # A-4503).
DAB = 3,3 '-diaminobenzidina Isopac (Sigma-Aldrich, catalogo D 9015).
Tripsina de pâncreas bovino (Sigma-Aldrich, catalogo T 4665).
Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Suécia)
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