Diminui quantificar cognitivos causados ​​pela radioterapia craniana

Nossos paradigmas testes cognitivos são esquematicamente diagramado na Figura 1. Testes cognitivos é iniciada um mês após a irradiação e procedimentos cirúrgicos são realizados.

Realização da Novel Coloque Reconhecimento Task (NPR)

1. A Novel Coloque Reconhecimento tarefa (NPR) é baseada em procedimentos descritos por Mumby e colegas (2002), e é uma tarefa de memória espacial reconhecimento de que depende o hipocampo ^4.
2. Ratos são os primeiros familiarizados com o contexto de testes, colocando-os nas áreas de teste (custom-made, branco, acrílico, open top boxes, 70cm X 70cm X 40cm de altura) por 20 minutos uma vez por dia durante três dias. Objetos que não serão utilizados para testes depois são colocados nas arenas durante estas sessões de habituação.
3. Para a fase de habituação, observações manual de comportamento exploratório Note-se, durante a gravação e monitoramento de comportamento não são necessárias.
4. Para todas as fases da tarefa NPR, as arenas são totalmente limpo entre os animais com etanol 70%, a fim de minimizar o odor sinais de confusão. Para todos os ensaios, os animais experimentadores lugar no centro das arenas de testes em uma orientação consistente para minimizar a possibilidade de que os animais simplesmente explorar o bloco que eles acontecem para ser colocado ao lado.
5. A fase de familiarização e de 5 minutos fase de teste são administrados no quarto dia.
6. Para a fase de familiarização, a dois quarteirões de plástico idênticos (8cm X 10cm X 3cm de altura) que tenham sido cuidadosamente limpos com etanol 70% são colocados em posições específicas dentro das arenas de testes. Um animal é colocado em cada arena para 5 minutos e permitiu explorar livremente.
7. Exploração dos dois igualmente familiar posições espaciais é marcado usando o sistema de rastreamento automatizado. Para todas as fases, a exploração é definido como ponto de um animal nariz estar dentro de um raio de 4cm de e dirigida para os blocos.
8. Parallowing a fase de familiarização, os animais são colocados em uma gaiola pequena exploração para um intervalo de atraso de 5 minutos. Durante este tempo, as arenas testes são limpos com etanol 70%, e cópias idênticas dos blocos são adicionados; um em uma posição idêntica espacial como durante a fase de familiarização, e um em uma posição romance espacial. Se um rato lembra o arranjo espacial dos blocos da fase de familiarização, vai gastar mais tempo explorando o bloco localizado na localização espacial romance.
9. Após o intervalo de atraso de 5 minutos, os animais são devolvidos para as arenas de testes para a fase de teste de 5 minutos. Eles exploram livremente por 3 minutos.
10. 24 horas após o final da fase de familiarização, os animais são devolvidos para as arenas de testar novamente para a fase de teste de 24 horas. Para esta fase, a uma quadra permanece na mesma posição durante a familiarização e fases de 5 minutos de teste, eo outro bloco é colocado em um novo romance posição espacial. Novamente, se uma re ratmembros do arranjo espacial dos blocos da fase de familiarização no dia anterior, ele vai gastar mais tempo explorando o bloco localizado na localização espacial romance.
11. Agora, a quantidade de tempo despendido a explorar os blocos em várias posições espaciais são coletados usando o programa de monitoramento automatizado, e podem ser analisados ​​estatisticamente para as diferenças entre os grupos experimentais.
12. Para a fase de familiarização, o tempo total despendido a explorar ambos os locais espacial em todo o julgamento é calculada. Não deve haver nenhuma diferença no tempo despendido a explorar as duas localizações espaciais durante esta fase como eles estão igualmente familiarizados / desconhecidos para os animais (Fig. 2A). Além disso, diferenças significativas na exploração total entre os grupos experimental pode indicar variações nos níveis de motivação do grupo para explorar ou ansiedade e deve ser considerada ao interpretar os resultados memória espacial de reconhecimento das duas fases de teste.
13. Tanto para o5 minutos e as fases de 24 horas de teste, uma relação de exploração é calculado da seguinte forma: o tempo gasto explorando posição romance - o tempo gasto explorando posição familiar / tempo total despendido a explorar (Fig. 2B). Desta forma, a variabilidade individual na motivação para explorar os objetos é levado em conta. Animais normais gastam muito mais tempo explorando a posição espacial romance do que o esperado pelo acaso (indicado pela linha pontilhada), após os intervalos de atraso de 5 minutos e 24 horas (Fig. 2B).
14. Relação de exploração é normalmente calculado para os primeiros 60 segundos de os testes de 5 minutos e 24 horas de ^4. Isto porque, como o avanço dos processos judiciais ensaio, a posição espacial romance se torna mais familiar para os animais. Assim, o primeiro minuto dos ensaios de teste fornece a avaliação mais precisa da memória de reconhecimento espacial.

2. Condução do labirinto em cruz elevado (EPM) Task

1. Os elevadosAlém disso tarefa Maze (EPM) é baseada em procedimentos de Walf e Frye, 2007 ^5.
2. A tarefa EPM é utilizado para avaliar a ansiedade em roedores. O aparelho EPM é um labirinto de 4 braços (45 "X 4") levantou 45 "a partir do nível do chão, com os braços dispostos em uma forma plus. Dois braços são fechados e dois abertos. O aparelho mostrado é fabricado pela Med Associates Inc .
3. Comportamento durante esta tarefa reflete um conflito entre a motivação natural do rato para explorar novos ambientes (tempo gasto de braços abertos) e preferência por permanecer em áreas protegidas (braços fechados).
4. A sala experimental é iluminada com holofotes apontados para o labirinto para garantir a motivação adequada para preferir o fechado, mais mal iluminada braços.
5. O labirinto é bem limpo antes de o primeiro animal é testado, e entre cada tentativa.
6. O animal é colocado no aparelho, segurando-o sob a patas dianteiras e colocando-a na porção centro do labirinto, de frente para o braço aberto que está longe deo experimentador. Cada ensaio tem a duração de 5 minutos.
7. O caminho do animal é monitorado usando o software de monitoramento automatizado para que o número de entradas e tempo gasto nos braços abertos e fechados podem ser calculados. Comportamentos adicionais, tais como aliciamento de criação, ea cabeça cai para o lado do aparelho pode ser monitorado. Uma entrada é contada quando o ponto central do animal atravessa um braço.
8. Se um rato cai do labirinto, é rapidamente colocado de volta no braço aberto do qual ele caiu, e o evento é registrado no caderno de observação. Se um rato congela por um período prolongado de tempo, o comportamento, juntamente com quaisquer possíveis causas (por exemplo, repentinos de ruído, alto fora da sala de teste) são anotados e testes continua para que todos os animais experimentais têm tempos de exposição similar.
9. Tempo gasto nos braços abertos versus fechamento é usado para calcular a razão: o tempo de braços abertos / tempo total de armas. Da mesma forma, a proporção de entradas para os braços abertos em oposição ao totalentradas nos braços é calculada. Usando o software de rastreamento automático, a distância total percorrida ea velocidade também pode ser medida a fim de avaliar eventuais diferenças na função motora entre os grupos experimentais.
10. Diminuição da ansiedade está associada com uma maior proporção de tempo gasto nos braços abertos, enquanto aumento da ansiedade e medo estão associados com mais tempo nos braços fechados. Animais normais gastam muito menos tempo nos braços abertos do que o esperado pelo acaso (indicado pela linha tracejada, fig. 3). Animais mais ansiosos vão gastar proporcionalmente menos tempo nos braços abertos, enquanto os animais menos ansiosos vão passar mais tempo nos braços abertos (por exemplo, após múltiplas exposições ao labirinto ou tratamento medicamentoso seguintes ansiolítico).

3. Conduzindo a Contextual e Avisada Medo condicionado Task (FC)

1. Contextual e Avisada medo condicionado descrições (FC) da tarefa são baseados em procedimentos de Schafe et al. 1999, Winocur et al., 2006 e MacLeod et al., 2007 ^6-8.
2. O medo condicionado tarefa (FC) é um paradigma de comportamento em que os animais aprendam a temer um estímulo anteriormente neutro (um contexto, uma luz ou um sinal, o estímulo condicionado) por emparelhamento com estímulo nocivo (normalmente um footshock leve; o estímulo incondicionado ). Aprendizado é rápido, robusto e de longa duração e, portanto, a tarefa FC é usada muitas vezes para estudar os circuitos neurobiológicos de aprendizagem e memória em roedores.
3. O aparelho é um FC 30cm x 30cm x 40cm câmara alta fechada (Phenotyper, Modelo 3000, Noldus Tecnologia da Informação). O piso da câmara consiste de uma grade de aço inoxidável, que é usada para fornecer o estímulo de choque. O Phenotyper está equipado com um alto-falante que emite um som, 2300Hz 90dB na demanda, agindo como o estímulo condicionado.
4. O choque é entregue através de um gerador de choque (Med Associates Inc.). O choque é um desconforto momentâneo que não produz nenhuma lasting dor ou dano tecidual. Para treinamento e ensaios de teste, a entrega do choque e estímulos tom é cronometrado e controlado automaticamente, usando o XT Ethovision add-on Trial e Módulo de Hardware Control (versão 7.0; Noldus Tecnologia da Informação).
5. No primeiro dia, o treinamento é realizado FC. O Phenotyper é cuidadosamente limpas com etanol 70%, e um único animal é colocado na câmara. O julgamento de treinamento consiste em três fases: (1) uma fase inicial, quando não há choque ou tom é administrado, (2) uma fase de treinamento, quando o tom de choque emparelhamentos são apresentadas, e (3) uma fase pós-treinamento, quando não choque ou tom é administrada. Cada fase dura aproximadamente 5 minutos para um tempo total de treinamento experimental de 15 minutos por animal.
6. Durante a fase de treinamento, o tom é administrado por 30 segundos e coincidente com o fim do tom, um choque de 1mA é entregue à rede por um segundo. Este emparelhamento tom de choque é repetida um total de 5 vezes, com uma variável de 10-60 second espaçamento intervalo entre cada par.
7. A partir da fase de treinamento, o percentual de tempo que cada animal passa imóvel, ou congelamento, é medido a partir do final de 60 segundos de fase de linha de base inicial (para estabelecer o congelamento espontâneo antes do emparceiramento tom-choque) e da final de 60 segundos de pós formação de fase (para estabelecer o comportamento de congelamento, em resposta ao tom de pares-choque). Animais normais apresentam níveis muito baixos de congelamento durante a fase de linha de base e muito alta (~ 95%) os níveis de congelamento durante a fase pós-treinamento (Fig. 4).
8. 24 horas depois, o animal é devolvido ao contexto idênticos e observados para o teste de FC 5 minutos contextual. Nenhum choque ou tom é entregue durante esta fase, e percentual de congelamento tempo gasto é calculada para todo o julgamento. Observe a importância de manter o contexto do treinamento constante para testar contexto. Na verdade, ter o experimentador mesmo manusear e testar os animais em ambos os dias é nesária. Animais normais gastam aproximadamente 70% do julgamento contexto envolvido no comportamento de congelamento (Fig. 4).
9. O teste de FC cued é administrado uma hora mais tarde. O contexto da câmara é alterado através da remoção do piso de grade, adicionando painéis para o exterior da câmara, e limpar o chão com uma solução de limpeza perfumada. Comportamento de congelamento do animal é observado para o primeiro minuto, e os níveis de congelamento são muito baixos se o contexto foi suficientemente alterada (Fig. 4). O tom é jogado por 3 minutos, seguido de um minuto final do silêncio e do tempo gasto percentual de congelamento é calculado. Animais normais apresentam altos níveis de congelamento durante este tempo (Fig. 4).
10. No total, cinco medidas discretas de comportamento de congelamento são coletados; (1) de base, (2) pós-treino, (3) teste de contexto; (4) pré-teste cue; (5) e pós-teste cue cue.
11. Ausência de congelamento durante a fase inicial estabelece os níveis de ansiedade normal, enquanto substancialmentecongelamento essenciais durante a fase pós-treinamento sugere capacidade sensório-motora intacta. Congelamento durante o teste de contexto estabelece 24 horas de memória para o contexto de formação, que se baseia na função do hipocampo e amígdala intacta ^9. A falta de pré-cue congelamento teste sugere alteração suficiente para o contexto de formação inicial. Congelamento e pós Cue cue-estabelece 24 horas de memória para o estímulo tom, que se baseia em função da amígdala intacta ^9.

4. Condução do labirinto aquático de Morris (MWM) Tarefa

1. Água Morris procedimentos tarefa Maze são baseados em descrições anteriores ^10,11.
2. A água Morris labirinto tarefa (MWM) é um teste de aprendizagem espacial para roedores que requer o uso de pistas distal para localizar uma plataforma de escape submerso em uma grande piscina de água opaca. Grandes, distintas pistas visuais são colocados ao redor da piscina em específico, locais constante. Animais aprender a usar esses sinais para navegar para o submerged plataforma. Os animais são monitorados e retirados da água, se eles são incapazes de nadar.
3. Aprendizagem espacial é avaliado em ensaios repetidos e memória de referência é determinado através da avaliação de preferência para a área da plataforma quando a plataforma está ausente. Ensaios de reversão aumentar a detecção de deficiências espacial, e pode tributar as regiões cerebrais adicionais, tais como o córtex frontal ^10.
4. A tarefa MWM é administrado ao longo de 8 dias e consiste de 4 fases: um teste cued, uma fase de aquisição, um teste de sonda de 24 horas e um teste de reversão de aprendizagem.
5. A piscina é uma custom-made tanque de polietileno branco, 200 centímetros de diâmetro e 60cm de altura. Ele é preenchido com água até cerca de 30 centímetros de profundidade e tornado opaco com o branco, tinta não tóxica. Temperatura da água é mantida entre 20 e 22 ° C (68 e 72 ° F). A plataforma de escape é uma custom-made, suporte de plástico transparente com um top 10 centímetros de diâmetro circular medição. Senta-se aproximadamente 1,5 cm abaixo da superfície do water.
6. O teste consiste em 4 cued ensaios administrada no dia 1. Para estes ensaios, uma bandeira distinta preto e branco é colocado no meio da plataforma para que o local de escape é óbvio para os animais. Para minimizar a utilização da informação espacial durante esta fase, pistas de parede são removidos ea plataforma e começar locais são variados de julgamento a julgamento. Esta fase ajuda a descartar quaisquer diferenças sensório-motor-relacionados entre os grupos experimentais antes da fase de aquisição começa.
7. Para todas as fases da tarefa MWM, os animais são mantidos sob os membros anteriores e gentilmente colocada na água na posição de início designado, de frente para a parede da piscina. Animais são testados em coortes de 8 de tal forma que há um minuto 8-10 inter-julgamento intervalo entre cada um dos 4 ensaios diários. Durante os intervalos inter-ensaio, os animais são mantidos em gaiolas para evitar o aquecimento hipotermia.
8. Para o teste cued, uma vez nadar máximo de 30 segundos é permitido para o animal para subir noplataforma. Se o tempo máximo for atingido antes da fuga dos animais, o pesquisador orienta-lo para a plataforma com a mão e coloca-o na plataforma. O animal permanece na plataforma para um período de descanso de 20 segundos antes de ser colocado em uma gaiola de aquecimento.
9. Para cada ensaio de teste cued, o animal é iniciado a partir de um local diferente de começar, pré-determinado no perímetro da piscina, ea plataforma é também mudou-se para cada uma das quatro posições diferentes quadrantes.
10. A fase de aquisição começa no dia seguinte e consiste de 4 ensaios por dia durante 5 dias consecutivos. Durante esta fase, a plataforma escondida permanece no mesmo local e os animais aprendem a navegar até ele usando as pistas quarto distal.
11. Novamente, para cada um dos quatro ensaios, o animal é colocado na piscina em um diferente ponto de partida, pré-determinado. Cada dia, dois dos pontos de partida estão à esquerda e dois dos pontos de partida estão à direita da plataforma, em ordem aleatória, para evitar o desenvolvimento de egocentric estratégias espaciais para resolver a tarefa.
12. O tempo máximo para nadar cada tentativa de aquisição é de 60 segundos, após o qual o animal é guiado para e colocado na plataforma pelo experimentador. O animal permanece na plataforma por 20 segundos após escapar.
13. No dia 7, 24h após o julgamento de treinamento final, um estudo da sonda de 60 segundos é administrada em que a plataforma é removido. Esta fase determina a preferência do animal para o quadrante que é utilizado para conter a plataforma e é usado como uma medida de memória de referência espacial ^10. Após o julgamento da sonda, a plataforma é devolvido ao mesmo quadrante e 3 ensaios aquisição regulares são administrados.
14. Para a reversão de aprendizagem teste no dia 8, a plataforma será movida para um novo local, a fim de avaliar a capacidade de reversão de aprendizagem. Medindo a quantidade de tempo gasto em busca de animais para a plataforma no seu local anterior versus o novo local oferece uma avaliação de perseveração, ou a inabilidade de suprimir responder para o local anterior uma vez que a plataforma tem sido movido ^10. Como para a aquisição e as fases de sonda, quatro de 60 segundos ensaios são administrados.
15. Para o teste cued, a latência para encontrar a plataforma e velocidade são utilizadas como medidas de visual e função motora, respectivamente. Diferenças entre os grupos experimentais durante esta fase devem ser tidos em conta na interpretação de aquisição e de memória resultados como diferenças na função sensório-motora entre os grupos possam existir.
16. Para a fase de aquisição, a média de latência para encontrar a plataforma e / ou comprimento do caminho são utilizados como medidas de aprendizado espacial. Em animais normais, escape de latência diminui gradualmente durante os cinco dias de aquisição de tal forma que o tempo de fuga significa a cerca de 15 a 20 segundos no dia 5 (Fig. 5A).
17. Para a fase de investigação, a média de distância para a plataforma (Fig. 5B) e / ou de latência para a primeira chegar localização anterior da plataforma (Fig. 5C
18. Para a fase de reversão, o tempo gasto por cento no quadrante antigo versus novo contendo a plataforma é usada como uma medida de perseveração. Durante os quatro ensaios, a preferência para a localização da plataforma de idade deve diminuir à medida que a preferência para a localização nova plataforma é estabelecida (Fig. 5D).

5. Resultados representativos:

Figura 1. Representação esquemática dos nossos paradigmas testes cognitivos.

Figura 2. Os resultados representativos de animais de controle na tarefa de reconhecimento de romance lugar. A) O tempo total despendido a explorar as duas posições espaciais deve ser aproximadamente igual durante a fase de familiarização. B) relação de Exploração (tempo gasto explorando novela posição / tempo a explorar ambas as posições) mostra uma clara preferência para a posição romance espacial após a intervalos de atraso de 5 minutos e 24 horas. A linha tracejada indica a performance chance.

Figura 3. Os resultados representativos de animais de controle no labirinto em cruz elevado. Animais normais gastam menos tempo do que o esperado por acaso nos braços abertos (indicado pela linha pontilhada). Animais ansiosos vai gastar proporcionalmente menos tempo nos braços abertos em comparação com controles, enquanto múltiplas exposições ao labirinto ou o tratamento com agentes ansiolíticos irá aumentar o tempo gasto nos braços abertos.

Figura 4. Os resultados representativos de animais de controle na tarefa de condicionamento de medo. Baixos níveis de congelamento são observados durante a exposição inicial à câmara (baseline), E quando o contexto é alterado antes do teste cue (pre-cue teste). Por outro lado, animais normais passam a maior parte do período pós-treino envolvidos em comportamento de congelamento. Se os animais recordar o contexto em que a formação ocorreu após um atraso de 24 horas, eles vão se envolver em comportamento de congelamento por aproximadamente 70% do julgamento contexto de 5 minutos. Da mesma forma, se os animais se lembrar o tom, eles mostram altos níveis de congelamento durante o teste e pós-cue cue.

Figura 5. Os resultados representativos de animais controle sobre a tarefa labirinto aquático de Morris. A) latência de escape diminui com o treinamento progressivo durante a fase de aquisição. B) e C) Distância média e latência para o primeiro cruzar a localização da plataforma anterior durante o teste de sonda 24h são utilizadas como medidas de memória de referência espacial. D) de aprendizado Reversão é avaliado por alterar a localização da plataforma no último dia de testing. Ao longo dos quatro ensaios, os animais normais gradualmente parar de procurar o quadrante de idade e saber que a plataforma está em um novo local.

Não há conflitos de interesse declarados.