Kartläggning Hämmande neuronala kretsar av Laser Scanning fotostimulering

Summary

Denna uppsats presenterar en metod att kombinera laserskanning fotostimulering med hela celler inspelningar i transgena möss som uttrycker GFP i begränsade hämmande neuron populationer. Tekniken möjliggör omfattande kartläggning och kvantitativ analys av de lokala synaptiska kretsar av specifika hämmande kortikala neuroner.

Abstract

Hämmande nervceller är avgörande för kortikalt funktion. De utgör omkring 20% av hela den kortikala neuronala populationen och kan indelas ytterligare i olika subtyper baserat på deras immunokemiska morfologiska och fysiologiska egenskaper ^1-4. Även tidigare forskning har visat mycket om inneboende egenskaper hos enskilda typer av hämmande nervceller är kunskap om de lokala kretsanslutningar fortfarande relativt begränsad ^3,5,6. Med tanke på att varje enskild neuron funktion formas av dess retande och hämmande synaptiska ingång inom kortikala kretsar, har vi använt laserskanning fotostimulering (LSP) att kartlägga lokala krets anslutningar till specifika hämmande celltyper. Jämfört med konventionell elektrisk stimulering eller glutamat puff stimulering, har LSP unika fördelar som möjliggör omfattande kartläggning och kvantitativ analys av de lokala funktionella ingångar till individuellt inspelad nervceller ^3,7-9. Laser fotostimulering via glutamat uncaging aktiverar selektivt nervceller perisomatically, utan att aktivera axoner av passagen eller distala dendriter, vilket garanterar en sub-laminär kartläggning upplösning. Känsligheten och effektivitet LSP för kartläggning input från många stimulering platser över ett stort område är väl lämpade för kortikal krets analys.

Här presenterar vi tekniken för LSP kombination med helcells-lapp fastspänning för lokal hämmande krets kartläggning. Riktade inspelningar av specifika hämmande celltyper underlättas genom användning av transgena möss som uttrycker grönt fluorescerande proteiner (GFP) i begränsade hämmande neuron populationer i cortex ^3,10, vilket möjliggör konsekvent urval av de riktade celltyper och otvetydig identifiering av de registrerade celltyper . När det gäller LSP kartläggning, beskriva vi systemet instrumentering, beskriva den experimentella förfarandet och datainsamling och presentera exempel på kretsens kartläggning i mus primär somatosensory cortex. Såsom illustreras i våra experiment, är caged glutamat aktiveras i ett rumsligt begränsat område av hjärnan skiva genom UV-laser fotolys, samtidiga spännings-clamp inspelningar möjliggöra detektering av fotostimulering framkallade synaptiska svar. Kartor av antingen excitatoriska eller inhiberande synaptisk inmatning till riktade neuronen genereras genom avsökning av laserstrålen att stimulera hundratals potentiella presynaptiska platser. Således kan LSP byggandet av detaljerade kartor över synaptiska ingångar infaller på specifika typer av hämmande nervceller genom upprepade experiment. Sammantaget erbjuder fotostimulering-baserad teknik neuroforskare ett kraftfullt verktyg för att bestämma den funktionella organisation av lokala kortikala kretsar.

Protocol

1. Brain skiva förberedelse

1. Transgena möss är djupt sövs med pentobarbitalnatrium (> 100 mg / kg, ip) och snabbt dekapiterades och deras hjärnor extraheras i ett fruset och syresatt lösning för kapning.
2. GFP glasögon används för att visuellt undersöka om musen hjärnan verkligen uttrycker GFP.
3. Primära somatosensoriska kortikala sektioner av 400 um tjocka skärs med en vibratom i sackaros-innehållande artificiell cerebrospinalvätska (ACSF). Segment först inkuberas i sackaros-innehållande ACSF under 30 min till 1 h vid 32 ° C och efter den inledande inkubationstiden, överfördes till inspelning ACSF vid rumstemperatur. Under hela inkubationen och inspelningen är skivorna kontinuerligt bubblades med 95% O ₂ -5% CO _2.

2. Utrustning start

Det totala systemet Genomförandet illustreras i figur 1.

1. Lasern kylsystem och elleverantör är Turned på, att få lasern redo.
2. All hårdvara avseende fotostimulering kontroll (inklusive avsökningsspegeln systemet, en optisk modulator, en elektronisk slutare och en fotodiod ingångsförstärkare) är påslagen.
3. Den elektrofysiologiska utrustning (inklusive en Multiclamp 700B förstärkare och mikromanipulatorer) är påslagen. Elektrofysiologiska inspelningar, fotostimulering och avbildning av skivan förberedelserna görs i en bit perfusionskammaren monterad på motoriserade skede av mikroskop.
4. Den bildkamera (Retiga 2000, Q-avbildning, Austin, TX) är påslagen. Skivor visualiseras med upprätt mikroskop (BW51X, Olympus) med infraröd differential interferens kontrast (DIC) och epi-fluorescerande optik genom avbildningssystemet.
5. Matlab-baserade EPHUS programvara och Q-capture kamera programvara startas. En anpassad modifierad version av Ephus programvara (Ephus, tillgänglig på https://openwiki.janelia.org/ </ A>) används för att styra fotostimulering protokoll och skaffa fotostimulering uppgifter.
6. När systemet är på, bör man kontrollera om lasern fotostimulering systemet är i ett fungerande tillstånd. Som 4x mikroskopobjektiv används för att leverera UV blinkar glutamat uncaging kan en bit vitt papper sättas i att observera laserskanning mönstret medan systemet körs.

3. Ställa in skiva perfusion

1. Ett trycksatt perfusionssystem slås på för att mata inspelningen ACSF i lådkammaren. Försiktighet vidtas för att säkerställa en konstant vätskenivå på 2,0 mm ovanför skivan i kammaren.
2. En alikvot av förrådslösningen av MNI inburat--glutamat sattes till 25 ml av cirkulerande ACSF för en koncentration av 0,2 mM glutamat bur. Observera att efter 5-6 h experiment kommer badet lösningen och MNI-glutamat uppdateras.
3. En hjärna skiva förs in i inspelningen kammaren. Man kan köra avbildning ssystemprogram för att kontrollera skiva kvalitet och anatomiskt lokalisera den primära somatosensoriska området. Sedan skivan är förankrad med en skräddarsydd stränginstrument platina ringen. Var noga med att inte sätta ankaret över hjärnan område som är avsett för inspelningar.

4. Helcells patch-klämma inspelning

1. Glaselektroder (4-6 Mohm motstånd) dras och fyllda med en inre lösning innehållande 0,1% biocytin för cellmärkning och morfologisk identifiering.
2. För att utföra patch inspelning celler visualiseras på 60x målet. Hämmande celltyper först identifieras och väljas baserat på visualisering av GFP uttryck under DIC / fluorescerande Olympus mikroskop, inspelningar därefter utförs under visuell kontroll med hjälp av infraröd DIC videoövervakning. Observera att ett par gånger för att växla mellan de DIC och fluorescerande lägen är nödvändigt att bekräfta GFP-cell plats medan närmar elektroden till målcellen.
3. Vid bryta i, är bilderna av cellen vid 60x under DIC och fluorescerande lägen tas för on-line kontroll. Innan insamlingen av fotostimulering data, hyperpolarisering och depolariserande strömpulser injicerade att undersöka varje cellens grundläggande elektrofysiologiska egenskaper.
4. När stabila hela celler inspelningar uppnås med god tillgång motstånd (vanligtvis <20 Mohm) är mikroskopobjektivet bytte från 60x till 4x för laserskanning fotostimulering. Den skiktbild vid 4x förvärvas och kommer att användas för att styra och registrera fotostimulering platser.

5. Laser scanning fotostimulering

1. Den fotostimulering och datainsamling parametrar anges genom att aktivera modulkonfigurationen byte av Ephus. Normalt 1 ms laser (20 mW) med en stimulans intervall på 1 sekund för fotostimulering kartläggning. Data spår av 1 sekund samplas med 10 kHz förvärvas.
2. 4x skiktbild laddas in i mapper modulen Ephus. Placeringen av cellens soma definieras och fotostimulering platser i ett 16x16 mönster (80 um x 80 um mellanrum) sätts upp runt cellen platsen, som omfattar alla de kortikala skikt.
3. Excitation profil inspelade neuron mappas genom att undersöka standardtillsatser platser som svar på fotostimulering på strömtång läge. Vår användarvänliga mjukvara med on-line display funktioner underlättar kartläggning experiment.
4. Lokala excitatoriska kretsanslutningar mappas genom detektering av excitatoriska postsynaptiska strömmar (EPSC) från inspelade cellen medan laserskanning vid olikaplatser. Cellen hålls vid -70 mV i spänning klämma läge för att upptäcka inåt excitatoriska strömmar. De EPSC kartorna upprepas 2-3 gånger med roterade fotostimulering mönster eller vänt.
5. Tillval: Lokala hämmande kretsanslutningar kan också kartlagt genom detektering av hämmande postsynaptiska strömmar (IPSC) från inspelade cellen hölls vid nära 0 mV i spänning klämma läge för att upptäcka yttre hämmande strömmar. Observera att det är bäst att använda elektroden intern lösning med kalium ersätts med cesium för IPSC kartläggning.
6. Efter alla fysiologiska analyser fullbordad elektroden försiktigt avlägsnas från den inspelade cellen. Hjärnan skiva tas ut och fixeras i 4% paraformaldehyd över natten. De inspelade cellerna färgas mot biocytin. Cellmorfologi undersöks med konfokal eller epi-fluorescensmikroskopi, vilket också bekräftar att varje inspelad cell är verkligen GFP-uttryckande interneuron tänkta.

6. Photostimulatjon dataanalys

Vår nyutvecklade metod och programvara genomförande ¹¹ appliceras på detektering och mätning av fotostimulering framkallade synaptiska händelser i rådata kartor. Såsom exemplifieras i fig 2, är färgkodade kartor konstruerades för att illustrera mönstret av synaptisk inmatning till den inspelade neuronen.

7. Representativa resultat:

Exempel resultat av elektrofysiologisk inspelning och fotostimulering kartläggning visas i figur 2. Riktade inspelningar av specifika hämmande celltyper görs möjligt genom att använda transgena möss som uttrycker GFP i kända hämmande celltyper. Med tanke på mångfalden av hämmande interneuronen är analyser av GFP uttryck, inneboende elektrofysiologi och morfologiska egenskaper (Figur 2A) kombineras för att komma fram till den slutliga celltyp klassificering. Figur 2B-C visar att laserskanning fotostimulering möjliggör omfattande kartläggning av lokala cortical kretsanslutningar till enskilda hämmande neuroner. Rådata karta visas i figur 2C. De direkta uncaging svaren exkluderas från dataanalysen (figur 2C). De kvantitativa input kartorna är färgkodade, som visas i figur 2D-F. Exemplet snabbt tillsatta hämmande interneuronen fått starkt excitatoriska synaptiska ingång (EPSCs) från lagret 4 och djupare lager. Genom att relatera cellens synaptisk input organisation definierade kortikala vägar, kan vi sluta sin möjliga roll (t.ex. feedback och framkoppling hämning) i kortikal informationsbehandling.

Figur 1. Generell ordning instrumentering för laserskanning fotostimulering. Vår övergripande system består av fotostimulering kontroll, video-avbildning och elektrofysiologiska system inspelning. Vi antog utformningen av LSP-systemet som beskrivits tidigare ^7,17. En laserenhet används för att generera 355 nm UV-lasER för glutamat uncaging. Laserstrålen riktas genom den optiska banan i vårt system. Korta löptider av laser blinkar (t.ex., 1 till 3 ms) styrs genom att använda en elektro-optisk modulator (dvs., pockelscellen) och en mekanisk slutare. Laserstrålens effekt moduleras av en neutral densitetsgradient hjul och övervakas genom att avleda en liten del av laserstrålen med ett täckglas till en fotodiod. Det laserskanning innefattar ett XY par scan speglar, skanningslinsen, röret lins, och objektivlinsen. Speglarna levererar laserstrålen genom en skanningslinsen, sedan strålen in i mikroskopet via en dikroisk spegel och fokuseras av en skräddarsydd UV-sändning rörlins. Strålen Underfill den bakre öppningen i mikroskopobjektivet att ge en mer kolonnformad (i motsats till konisk) belysningsstrålen, hålla kartläggning som tvådimensionella som möjligt genom att minska den axiella upplösningen. Enligt 4x målet utgör laserstrålen uncaging fläckar, varje approximating en Gaussisk profil med en bredd på 153 nm i sidled vid fokalplanet (se insatsen). Olika laser stimulering positioner kan åstadkommas genom galvanometrar-driven XY avsökningsspeglar, eftersom speglarna och den bakre öppningen av det mål i konjugerade plan, översätta spegel positioner i olika skanning platser på objektivlinsen fokalplan. Under uncaging är ett varierande antal mönstrade områden som täcker hela fältet stimuleras sekventiellt i en nonraster, icke slumpvis sekvens för att undvika återbesök i närheten av nyligen stimulerade platser. Se Xu et al. (2010) för mer detaljerad information.

Figur 2. Kartläggning lokala excitatoriska krets anslutningar till en GFP-uttryckande snabbt tillsatta interneuron i lager 4 av mus primära sensoriska hjärnbarken. A1 och A2 visar DIC och GFP fluorescerande bilder av målcellen under 60xmål i levande hjärnan skiva, medan A3 visar cellmorfologin avslöjades av biocytin färgning i efter inspelningen, fast skiva. A4 visar bränning mönster av inspelade GFP cellen kännetecknande för en snabbt tillsatta hämmande interneuron, som svar på intrasomatic nuvarande injektioner av olika styrkor. B visar skiktbild överlagrad med 16 x16 fotostimulering platser (*). Cellen position visas med den lilla röda cirkeln. C visar en rad fotostimulering-framkallat svar spår från stimulering platser som visas i B, medan cellen hölls vid -70 mV för att upptäcka inåt excitatoriska strömmar. Olika former av fotostimulering svar illustreras av spåren vid platserna för 1 och 2, som är expanderade och separat anges i insatsen. Kurvan 1 är ett exempel på de direkta svar (indikeras av de röda pilhuvuden) för glutamat uncaging på cellkroppen och promximal dendriter. Andra spår i 2 är typiska exempel på excitatorisk synaptisk isätta svar (blå). Direkta svar och synaptiska ingångar kan särskiljas genom deras amplituder och latenser svar. D, E och F är de färgkodade kartor (16x16 ställen) med genomsnittlig EPSC amplitud, de EPSC siffror och den första detekterade EPSC latens per plats respektive för rådata karta som visas i C. Den genomsnittliga ingångsamplitud från varje stimulering webbplats är den genomsnittliga amplituden EPSCs i analysen fönstret med baslinjen spontana responsen subtraheras från fotostimulering svar samma plats. Antalet EPSCs och ankomsttiden eller latens på den detekterade första EPSC per sida mäts också och plottades. Se (Shi et al., 2010) för mer information.

Discussion

Fotostimulering-baserade kartläggning tekniker har faktiskt tillämpas för att analysera kortikala kretsar. Laserskanning fotostimulering kombination med helcells inspelning tillåter hög upplösning kartläggning av laminära fördelningar av presynaptiska ingångskällor till enskilda neuroner, eftersom samtidig inspelning från en postsynaptisk neuron med fotostimulering av kluster av presynaptiska neuron vid många olika platser ger kvantitativa mått på rumsliga fördelningen av excitatoriska eller hämmande ingångar. Denna teknik med hjälp av att använda transgena möss som uttrycker GFP i kända hämmande celltyper har i hög grad underlättat vårt nuvarande arbete mot att belysa lokala hämmande kortikala nätverk. I exemplet studien använde vi caged glutamat för att aktivera neuroner i ett rumsligt begränsa sätt på laser uncaging. Det bör noteras att glutamat uncaging kan ersättas med fotoaktivering via channelrhodopsin eller annan genetiskt kodad ljuskänsliga molecules i specifika celltyper ^12,13. Således fotostimulering tekniken är det möjligt att rikta inte bara vissa kortikala regioner men också specifik delmängd av nervceller i de deltagande kretsarna ^14-16. Dessutom utvecklade vi nyligen en ny fotostimulering-baserad kartläggning teknik ⁹ som innefattar den rumsliga precisionen av aktivering som kan uppnås genom laser-scanning fotostimulering med snabb och hög tidsupplösning bedömning av framkallat nätverk aktivitet som kan uppnås genom spänningskänsliga färgämne avbildning. Till skillnad från en kombination av hela celler inspelningar med fotostimulering för kartläggning lokala krets ingångar till individuellt inspelade nervceller kan denna innovation kan användas för att kartlägga kortikal utsignal och funktionella anslutningar i nivå med neuronala populationer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
transgenic mouse lines	Jackson lab or other sources		Please refer to Xu and Callaway (2009)
GFP goggles	BLS Ltd., Hungary
vibratome	Leica Systems	VT1200S
MNI caged glutamate (4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged l-glutamate)	Tocris Bioscience, Ellisville, MO	Cat No. 1490
biocytin		B4261
electrode puller	Sutter Instrument, Novato, CA	P-97
glass tubes for making electrodes		BF150-86-10
Multiclamp 700B amplifier	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	Multiclamp 700B
digital CCD camera	Q-imaging, Austin, TX	Retiga 2000
Research microscope	Olympus, Tokyo, Japan	BW51X
UV laser unit	DPSS Lasers, Santa Clara, CA	model 3501
Other equipment for Laser scanning phostimulation			Please refer to Xu et al. (2010)
Solutions:
Sucrose-containing artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for slice cutting (in mM: 85 NaCl, 75 sucrose, 2.5 KCl, 25 glucose, 1.25 NaH2PO4, 4 MgCl2, 0.5 CaCl2, and 24 NaHCO3). Recording ACSF (in mM: 126 NaCl, 2.5 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, and 10 glucose) Electrode internal solution (in mM: 126 K-gluconate, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na, and 10 phosphocreatine; pH 7.2, 300 mOsm).