$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Configuração e preparação da amostragem
- Suplemente a solução salina balanceada de Earle (EBSS) com bicarbonato de sódio (0,44 g por 100 mL de EBSS) e glicose (0,884 g por 100 mL de EBSS)9. Trate o EBSS com DEPC (0,1 mL por 100 mL de EBSS) por pelo menos 12 horas a 37 ° C em um frasco autoclavável ou frasco com tampa de rosca.
- Coloque pipetas Pasteur de vidro de 5 3/4" em um copo de vidro de 1000 mL e coloque os pincéis do artista, com as cerdas voltadas para cima, em um cilindro graduado de vidro de 100 mL. Adicione solução DEPC suficiente (0,1 mL por 100 mL ddH2O) para cobrir as pipetas e escovas, respectivamente. Cobrir o copo e a garrafa graduada com folha de alumínio e incubar durante, pelo menos, 12 horas a 37 °C.
- Após 12 horas de incubação com DEPC, aqueça todos os materiais tratados com DEPC a uma temperatura >100 °C por pelo menos 15 minutos. Remover o EBSS e arrefecer até à temperatura ambiente antes de conservar a 4 °C. Deite ddH2O para longe do copo e do cilindro graduado; continue a incubar a >100 °C até que os materiais estejam secos. Retire, deixe esfriar até a temperatura ambiente e guarde para uso posterior.
- No dia do experimento, trate todas as superfícies de trabalho com RNaseZap.
- Colocar e manter o EBSS em banho-maria regulado para 40 °C. Para tamponar e oxigenar o EBSS, infiltre-se com 95%/5% de O2/CO2 colocando a tubulação de gás em uma pipeta de Pasteur livre de RNase e inserindo a pipeta no EBSS. Cubra a abertura do recipiente EBSS.
- Configure um cortador de tecido Stoelting para uso na seccionamento em série do tecido cerebral. Trate as superfícies superior e inferior do cortador de tecido com RNaseZap. Prenda um pedaço retangular de papel de filtro Whatman # 4 na superfície de plexi-glass do picador de tecidos. Prenda uma lâmina de barbear de dois gumes ao braço do picador. Defina o micrômetro para zero e ajuste a altura mínima do braço do picador para permitir que a lâmina de barbear corte o papel de filtro, mas não a placa de plexi-glass.
- Reúna todos os materiais adicionais necessários para a microdissecção, incluindo placas de cultura de células sem RNase de 60x15 mm, sondadores de tecido Harris Uni-Core, pontas de micropipeta sem RNase de 200 μL para fixação em tubulação de gás para oxigenação EBSS de seções cerebrais coronais durante a perfuração de microamostras, tesouras curvas, gelo seco e tubos para coleta de tecido. Coloque os tubos em gelo seco.
2. Remoção do cérebro e secção coronal
- Coloque o rato em um DecapiCone e decapite usando uma guilhotina de roedores. Remova a cabeça do DecapiCone e coloque sobre uma superfície plana. Usando um bisturi, corte a pele na linha média do crânio, começando aproximadamente 3 mm caudal à narina. Retire lateralmente as abas da pele para expor o crânio e as órbitas oculares.
- Usando uma tesoura curva, corte os dois nervos ópticos, cortando sua conexão com o olho. Abra a cavidade craniana quebrando cuidadosamente os ossos occipital e interparietal e removendo os ossos parietal dorsal e frontal. Usando um rongeur ósseo, quebre os ossos nasais e lacrimais para expor os bulbos olfatórios. Use uma tesoura curva para cortar os bulbos olfatórios do cérebro rostral. Remova todo o cérebro com o rombencéfalo intacto. Coloque o cérebro no topo de uma placa de cultura de células Cellstar sem RNase de 60 x 15 mm. Transferir para a superfície de trabalho de recolha de amostras de tecidos.
- Use uma pipeta sem RNase para umedecer de forma conservadora o papel de filtro no picador de tecidos anexado com EBSS. Molhe o tecido cerebral com EBSS.
- Transfira o cérebro para o helicóptero de tecidos e estabeleça a orientação apropriada. Nota: O cérebro deve ser posicionado com a superfície ventral apoiada no papel de filtro. A linha média (fissura inter-hemisférica) deve ser perpendicular à lâmina do picador, e a borda rostral do cérebro deve encostar na lâmina.
- Use um pincel de artista tratado com DEPC para manter o cérebro parado, aplicando uma leve pressão na superfície dorsal do cérebro. Enquanto segura o cérebro parado, levante a alavanca do porta-lâminas cerca de 4-5 cm acima da superfície do tecido dorsal e segure-a nesta posição. Remova a escova da superfície do cérebro e disque 750 μm usando o micrômetro. Deixe a alavanca cair, cortando o tecido e criando uma seção coronal de 750 μm.
- Enquanto a lâmina do picador permanece estacionária, use um movimento de rolamento com o pincel do artista para deslizar suavemente a seção de tecido para longe da superfície da lâmina. Coloque imediatamente a seção de tecido no EBSS oxigenado na placa de Petri. Um segundo investigador pode começar na etapa 3.1.
- Repita as etapas 2.5 e 2.6 até que seções cerebrais seriadas tenham sido obtidas em todo o plano rostro-caudal.
3. Microdissecção da região cerebral
- Ajuste a iluminação para garantir que a iluminação da amostra não seja obstruída durante a microdissecção do tecido. Ajuste a posição e o fluxo da mistura de 95%/5% de O2/CO2 para manter um ambiente tamponado e oxigenado para o tecido durante a microdissecção.
- Identifique a seção coronal do cérebro que inclui a região de interesse. Oriente a seção do cérebro plana no fundo da placa de Petri usando um pincel de artista. Selecione o descaroçador de tecido com diâmetro apropriado com base na Tabela 1 ou em outras referências. Enquanto segura a seção de tecido coronal no lugar com o pincel do artista, traga a ponta de corte do descaroçador de tecido para baixo sobre a superfície da seção de tecido.
- Enquanto aplica pressão, pressione a ponta do descaroçador de tecido através da seção de tecido e para baixo firmemente no fundo da placa de Petri. Use um movimento circular rolante para garantir que a região de interesse tenha sido dissociada do tecido circundante. Levante cuidadosamente o descaroçador de tecido da seção de tecido e libere o micropunch, permitindo que ele flutue no EBSS.
- Usando um pincel de artista, deposite imediatamente o micropunch de tecido em um tubo de armazenamento estável a -80 °C mantido em gelo seco. O tecido deve aderir prontamente à lateral do tubo. Retorne o tubo contendo microsample para o gelo seco.
- Repita as etapas 3.2 a 3.4 para cada região do cérebro de interesse.
4. Arquivamento de tecidos
- Quando a microdissecção estiver concluída, use o sistema de scanner VisionMate para registrar os respectivos códigos de barras para cada tubo TrakMates contendo amostra. Uma vez que o suporte de tubo TrakMates de 96 slots tenha sido preenchido, escaneie rapidamente o rack e coloque imediatamente as amostras de tecido em um freezer de -80 ° C até a extração do RNA.
5. Extração total de RNA
- Prepare um espaço de trabalho livre de RNase usando RNaseZap. Prepare uma quantidade suficiente de mistura de esferas magnéticas e solução de lise/ligação conforme descrito no Protocolo de Isolamento de RNA Total MagMAX-9610.
- Remova amostras de tecido do freezer a -80 °C e coloque os tubos diretamente sobre gelo seco.
- Adicione 100 μL da solução de lise/ligação a um tubo TrakMates contendo amostra. Anexe um pilão do tamanho de um tubo de 0,5 ml sem nuclease ao misturador de pellets e homogeneize o tecido. Usando uma ponta de pipeta livre de nuclease de baixa retenção, transfira a amostra homogeneizada para um poço em uma placa de cultura de tecidos de fundo redondo de 96 poços. Adicione imediatamente 60 μL de isopropanol 100% à amostra usando uma ponta de pipeta livre de nuclease de baixa retenção e misture pipetando para cima e para baixo 3-4 vezes.
- Adicione 20 μL da mistura de grânulos à amostra usando uma ponta de pipeta livre de nuclease de baixa retenção. Misture pipetando para cima e para baixo 3-4 vezes.
- Repita as etapas 5.3-5.4 para todas as amostras de tecido.
- Siga as etapas do Protocolo de Isolamento de RNA Total MagMAX-96 começando em III.A.2 para concluir a extração de RNA total. nota: Outros kits de isolamento de RNA total habilitados para esferas magnéticas estão disponíveis comercialmente; no entanto, eles não foram examinados neste estudo. Consulte os manuais do kit do fabricante para obter os detalhes do isolamento total do RNA usando os respectivos produtos.
- Meça a pureza e a concentração do RNA total resultante usando um espectrofotômetro NanoDrop 3300 ou outras tecnologias de espectrofotômetro/fluorômetro de pequeno volume.
6. Resultados representativos:
Região/Núcleo do Cérebro
Diâmetro do descaroçador de tecido (mm)
RNA total (ng/μL)
Relação 260/280
Córtex Frontal
2.0
27.03
1,99
Núcleo Accumbens
1.0
6.26
2,77
Striatum
1.5
27,94
2.19
Córtex cingulado
1.5
29.05
2.07
Hipotálamo - Núcleo Paraventricular / Núcleo Supraquiasmático (PVN/SCN)
2.0
40,34
2.03
tálamo
2.0
34.40
2,00
Hipotálamo - Núcleo Dorsomedial / Núcleo Ventromedial (DMH/VMH)
2.0
44.83
2.05
amígdala
1.0
10.06
1,89
Hipocampo - Ca 2/3
1.5
7.31
2.32
Hipocampo - Ca1/Giro Dentado
1.5
5.20
2.24
Cinza Periaquedutal
1.0
48.21
2.02
Núcleo Dorsal da Rafe
1.0
6.56
2.18
Formação Reticular
2.0
35.35
2,27
Tabela 1. Enumeração de regiões cerebrais de camundongos microdissecados com os respectivos diâmetros ideais do núcleo do tecido, rendimento e pureza representativos do RNA total. As 13 regiões cerebrais microdissecadas, listadas em ordem rostro-caudal, variam em tamanho e orientação. O micropunch PVN/SCN inclui o núcleo paraventricular anteromedial, porções do núcleo periventricular, a zona subparaventricular e outros neurônios parvocelulares. O micropunch do tálamo inclui núcleos talâmicos anteriores situados no mesmo plano coronal da região do micropunch PVN/SCN. O micropunch DMH/VMH inclui núcleos magnocelulares acessórios e outros neurônios parvocelulares situados entre o núcleo dorsomedial e o núcleo ventromedial. A amostra da amígdala inclui as sub-regiões central e basolateral. O rendimento de RNA e as proporções 260/280 são valores únicos obtidos das respectivas amostras de microdissecção para demonstrar as leituras obtidas de cada região do cérebro.