O perfilamento da expressão de RNA em regiões discretas do cérebro de camundongos exige uma estratégia precisa e repetível de coleta de tecidos. Aqui é descrito um protocolo que utiliza o seccionamento coronal do cérebro e a microdissecação assistida por perfurador de tecidos. O rendimento e a qualidade do RNA total obtido a partir das amostras resultantes confirmam a utilidade do método descrito.
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Artigo de método
Laser não-Abordagem Microscopia de captura para o Microdissecção de regiões cerebrais discretas Mouse para isolamento de RNA total e Seqüenciamento Next-Generation Downstream e perfil de expressão gênica
Neste artigo
Resumo
Resumo
Como plataformas tecnológicas, abordagens como sequenciamento de nova geração, microarranjos e qRT-PCR têm grande potencial para ampliar nossa compreensão da amplitude da regulação molecular. Abordagens mais recentes, como o sequenciamento de RNA de alta resolução (RNA-Seq)1, fornecem informações novas e abrangentes sobre a expressão específica de tecidos ou estados, tais como níveis relativos de transcritos, splicing alternativo e microRNAs2-4. As perspectivas para o emprego do método RNA-Seq em perfis comparativos do transcriptoma completo5 dentro de tecidos discretos ou entre grupos fenotipicamente distintos de indivíduos oferecem novas vias para elucidar os mecanismos moleculares envolvidos em estados fisiológicos normais e anormais. Recentemente, o perfilamento do transcriptoma completo foi realizado em tecido cerebral humano, identificando diferenças na expressão gênica associadas à progressão da doença6. No entanto, o uso do sequenciamento de nova geração ainda não foi amplamente integrado aos estudos em mamíferos.
Estudos de expressão gênica em modelos de camundongo relataram perfis distintos em diversos núcleos cerebrais utilizando microdissecção a laser (LCM) para a excisão da amostra7,8. Embora a LCM permita a coleta de amostras com precisão em nível de célula única e de regiões cerebrais discretas, os rendimentos relativamente baixos de RNA total obtidos por meio da abordagem de LCM podem ser limitantes para o RNA-Seq e outras técnicas de perfilamento em tecidos cerebrais de camundongo, podendo exigir etapas subótimas de amplificação da amostra. Aqui, apresenta-se um protocolo para microdissecção e extração de RNA total de regiões cerebrais discretas de camundongo. Perfuradores de tecido com diâmetro fixo são utilizados para isolar 13 tecidos de cortes coronais seriados de 750 μm de um cérebro individual de camundongo. As amostras de microperfuração de tecido são imediatamente congeladas e arquivadas. O RNA total é obtido a partir das amostras utilizando tecnologia de isolamento de RNA total com uso de microesferas magnéticas. As amostras de RNA resultantes apresentam rendimento e qualidade adequados para uso em análises de perfil de expressão downstream. Essa estratégia de microdissecção fornece uma opção viável frente às estratégias existentes de coleta de amostras para obtenção de RNA total de regiões cerebrais discretas, abrindo possibilidades para novas descobertas em expressão gênica.
Protocolo
1. Configuração e preparação da amostragem
- Suplemente a solução salina balanceada de Earle (EBSS) com bicarbonato de sódio (0,44 g por 100 mL de EBSS) e glicose (0,884 g por 100 mL de EBSS)9. Trate a EBSS com DEPC (0,1 mL por 100 mL de EBSS) por pelo menos 12 horas a 37 °C em um frasco ou garrafa autoclavável com tampa de rosca.
- Coloque 5 pipetas de vidro Pasteur de 5 ¾" em um béquer de vidro de 1000 mL e posicione pincéis de artista, com as cerdas voltadas para cima, em um cilindro graduado de vidro de 100 mL. Adicione quantidade suficiente de solução de DEPC (0,1 mL por 100 mL de ddH2O) para cobrir as pipetas e os pincéis, respectivamente. Cubra o béquer e o cilindro graduado com papel alumínio e incube por pelo menos 12 horas a 37 °C.
- Após a incubação de 12 horas com DEPC, aqueça todos os materiais tratados com DEPC a uma temperatura >100 °C por pelo menos 15 minutos. Remova a EBSS e resfrie até a temperatura ambiente antes de armazenar a 4 °C. Descarte a ddH2O do béquer e do cilindro graduado; continue a incubação a >100 °C até que os materiais estejam secos. Remova, resfrie até a temperatura ambiente e armazene para uso posterior.
- No dia do experimento, trate todas as superfícies de trabalho com RNaseZap.
- Coloque e mantenha a EBSS em um banho-maria ajustado a 40 °C. Para tamponar e oxigenar a EBSS, infiltre com O2/CO2 95%/5% inserindo um tubo de gás em uma pipeta Pasteur livre de RNase e colocando a pipeta na EBSS. Cubra a abertura do recipiente com EBSS.
- Prepare um fatiador de tecidos Stoelting para uso no corte seriado do tecido cerebral. Trate as superfícies superior e inferior do fatiador de tecidos com RNaseZap. Fixe um pedaço retangular de papel-filtro Whatman #4 na superfície de plexiglass do cortador de tecidos. Fixe uma lâmina de barbear de dupla face ao braço do cortador. Ajuste o micrômetro para zero e regule a altura mínima do braço do cortador para que a lâmina corte o papel-filtro, mas não o placa de plexiglass.
- Reúna todos os materiais adicionais necessários para a microdissecção, incluindo placas de cultura celular RNase-free de 60x15 mm, perfuradores de tecido Harris Uni-Core, ponteiras de micropipeta RNase-free de 200 μL para fixar ao tubo de gás para oxigenação da EBSS de cortes coronais cerebrais durante a perfuração de microamostras, tesouras curvas, gelo seco e tubos para coleta de tecido. Coloque os tubos sobre gelo seco.
2. Remoção do cérebro e secção coronal
- Coloque o camundongo em um DecapiCone e decapite-o usando uma guilhotina para roedores. Remova a cabeça do DecapiCone e coloque-a sobre uma superfície plana. Com um bisturi, corte a pele ao longo da linha média do crânio, iniciando aproximadamente 3 mm caudalmente à narina. Puxe lateralmente as abas de pele para expor o crânio e as órbitas oculares.
- Com tesoura curva, corte os dois nervos ópticos, rompendo sua conexão com o olho. Abra a cavidade craniana quebrando cuidadosamente os ossos occipital e interparietal e removendo os ossos parietais dorsais e frontal. Com um alicate de ossos, quebre os ossos nasais e lacrimais para expor os bulbos olfativos. Use a tesoura curva para cortar os bulbos olfativos da região rostral do cérebro. Remova todo o cérebro mantendo o cérebro posterior intacto. Coloque o cérebro na parte superior de uma placa de cultura celular Cellstar de 60 x 15 mm, livre de RNase. Transfira para a superfície de trabalho para coleta de tecido.
- Use uma pipeta livre de RNase para umedecer moderadamente o papel-filtro fixado ao fatiador de tecidos com EBSS. Umedeça o tecido cerebral com EBSS.
- Transfira o cérebro para o fatiador de tecidos e posicione-o adequadamente. Observação: o cérebro deve ser posicionado com a superfície ventral apoiada sobre o papel-filtro. A linha média (fissura inter-hemisférica) deve estar perpendicular à lâmina do fatiador, e a borda rostral do cérebro deve encostar na lâmina.
- Use um pincel de artista tratado com DEPC para manter o cérebro imóvel, aplicando leve pressão sobre a superfície dorsal do cérebro. Enquanto mantém o cérebro imóvel, levante a alavanca do suporte da lâmina cerca de 4-5 cm acima da superfície dorsal do tecido e mantenha-a nessa posição. Remova o pincel da superfície do cérebro e regule 750 μm no micrômetro. Solte a alavanca, fatiando o tecido e produzindo uma seção coronal de 750 μm.
- Enquanto a lâmina do fatiador permanece imóvel, use um movimento de rolagem com o pincel para suavemente afastar a seção de tecido da superfície da lâmina. Coloque imediatamente a seção de tecido no EBSS oxigenado dentro da placa de Petri. Um segundo pesquisador pode iniciar no passo 3.1.
- Repita os passos 2.5 e 2.6 até que seções cerebrais seriadas tenham sido obtidas em todo o plano rostro-caudal.
3. Microdissecação de regiões cerebrais
- Ajuste a iluminação para garantir que a iluminação da amostra não seja obstruída durante a microdissecção do tecido. Ajuste a posição e o fluxo da mistura 95%/5% de O2/CO2 para manter um ambiente tamponado e oxigenado para o tecido durante a microdissecção.
- Identifique a seção coronal do cérebro que inclui a região de interesse. Oriente a seção cerebral plana no fundo da placa de Petri utilizando um pincel de artista. Selecione o cortador de tecido com o diâmetro apropriado com base na Tabela 1 ou outras referências. Enquanto mantém a seção coronal do tecido no lugar com o pincel de artista, posicione a ponta cortante do cortador de tecido sobre a superfície da seção.
- Aplicando pressão, pressione a ponta do cortador de tecido através da seção do tecido e firmemente contra o fundo da placa de Petri. Utilize um movimento circular rolante para garantir que a região de interesse tenha sido dissociada do tecido circundante. Levante cuidadosamente o cortador de tecido da seção e libere o micropunção, permitindo que flutue no EBSS.
- Utilizando um pincel de artista, deposite imediatamente o micropunção de tecido em um tubo de armazenamento estável a -80 °C mantido sobre gelo seco. O tecido deve aderir prontamente à parede do tubo. Retorne o tubo contendo a microamostra ao gelo seco.
- Repita os passos 3.2 a 3.4 para cada região cerebral de interesse.
4. Arquivamento de tecidos
- Após a conclusão da microdissecção, utilize o sistema de scanner VisionMate para registrar os códigos de barras respectivos de cada tubo TrakMates contendo amostras. Uma vez que a placa de tubos TrakMates com 96 posições tenha sido preenchida, escaneie rapidamente a placa e coloque imediatamente as amostras de tecido em um congelador a -80 °C até a extração de RNA.
5. Extração de RNA total
- Prepare um ambiente de trabalho livre de RNase utilizando RNaseZap. Prepare uma quantidade suficiente da Mistura de Microesferas Magnéticas e da Solução de Lisamento/Ligação conforme descrito no Protocolo de Isolamento de RNA Total MagMAX-9610.
- Retire as amostras de tecido do congelador a -80 °C e coloque os tubos diretamente sobre gelo seco.
- Adicione 100 μL da Solução de Lisamento/Ligação a um tubo TrakMates contendo a amostra. Fixe um pistilo nuclease-free de tamanho adequado para tubo de 0,5 ml ao misturador de pellets e homogeneíze o tecido. Usando uma ponteira nuclease-free de baixa retenção, transfira a amostra homogeneizada para um poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços com fundo redondo. Adicione imediatamente 60 μL de isopropanol a 100% à amostra usando uma ponteira nuclease-free de baixa retenção e misture pipetando para cima e para baixo 3-4 vezes.
- Adicione 20 μL da Mistura de Microesferas à amostra usando uma ponteira nuclease-free de baixa retenção. Misture pipetando para cima e para baixo 3-4 vezes.
- Repita os passos 5.3-5.4 para todas as amostras de tecido.
- Siga os passos do Protocolo de Isolamento de RNA Total MagMAX-96 a partir do item III.A.2 para concluir a extração de RNA total. NOTA: Outros kits comerciais de isolamento de RNA total com uso de microesferas magnéticas estão disponíveis; no entanto, não foram examinados neste estudo. Consulte os manuais dos fabricantes dos kits para obter detalhes sobre o isolamento de RNA total utilizando os respectivos produtos.
- Meça a pureza e a concentração do RNA total obtido utilizando um espectrofotômetro NanoDrop 3300 ou outras tecnologias de espectrofotômetro/fluorímetro de pequeno volume.
6. Resultados Representativos:
| Região Cerebral/Núcleo | Diâmetro do Cortador de Tecido (mm) | RNA Total (ng/μL) | Razão 260/280 |
| Córtex Frontal | 2,0 | 27,03 | 1,99 |
| Núcleo Accumbens | 1,0 | 6,26 | 2,77 |
| Estriado | 1,5 | 27,94 | 2,19 |
| Córtex Cingulado | 1,5 | 29,05 | 2,07 |
| Hipotálamo - Núcleo Paraventricular / Núcleo Supraquiasmático (PVN/SCN) | 2,0 | 40,34 | 2,03 |
| Tálamo | 2,0 | 34,40 | 2,00 |
| Hipotálamo - Núcleo Dorsomedial / Núcleo Ventromedial (DMH/VMH) | 2,0 | 44,83 | 2,05 |
| Amígdala | 1,0 | 10,06 | 1,89 |
| Hipocampo - CA 2/3 | 1,5 | 7,31 | 2,32 |
| Hipocampo - CA1/Giro Denteado | 1,5 | 5,20 | 2,24 |
| Cinza Periaquedutal | 1,0 | 48,21 | 2,02 |
| Núcleo Dorsal da Rafe | 1,0 | 6,56 | 2,18 |
| Formação Reticular | 2,0 | 35,35 | 2,27 |
Tabela 1. Enumeração de regiões cerebrais de camundongo microdissecadas com os respectivos diâmetros ótimos dos perfuradores de tecido, rendimento total representativo de RNA e pureza. As 13 regiões cerebrais microdissecadas, listadas em ordem rostro-caudal, variam em tamanho e orientação. A punção microcirúrgica da PVN/SCN inclui o núcleo paraventricular anteromedial, porções do núcleo periventricular, a zona subparaventricular e outros neurônios parvocelulares. A punção microcirúrgica do tálamo inclui núcleos talâmicos anteriores situados no mesmo plano coronal da região da punção microcirúrgica da PVN/SCN. A punção microcirúrgica da DMH/VMH inclui núcleos magnocelulares acessórios e outros neurônios parvocelulares situados entre o núcleo dorsomedial e o núcleo ventromedial. A amostra da amígdala inclui as subregiões central e basolateral. O rendimento de RNA e as razões 260/280 são valores únicos obtidos a partir de amostras respectivas de microdissecção para demonstrar as leituras obtidas de cada região cerebral.
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Discussão
Existem muitas etapas críticas neste protocolo que requerem atenção e consideração cuidadosas. A seleção do diâmetro apropriado do cortador de tecido deve ser determinada para a remoção de cada região de interesse específica. Embora os diâmetros dos cortadores de tecido apresentados na Tabela 1 sejam adequados para a coleta das regiões cerebrais listadas, cada pesquisador deve determinar o cortador de tecido de tamanho apropriado para uma coleta ideal de seus respectivos tecidos de interesse. Em segundo lugar, a espessur...
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Divulgações
Nenhum conflito de interesses declarado.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) e pela Army Research Office (ARO), número do prêmio W911NF-10-1-006.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Banho-maria Isotemp 102 | Fisher Scientific | 15-460-3Q | |
| RNase Zap | Ambion | AM9782 | |
| Rotador de laboratório (agitador orbital) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314 –- 1CEQ | |
| Misturador de pellets | VWR international | 47747-370 | |
| Pistilo de 0,5 mL livre de RNase | VWR international | KT749521-0590 | Livre de nucleases |
| Pirocarbonato de dietila (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-50ML | |
| Lâminas de barbear de dupla face | Stoelting Co. | 51427 | |
| St–Fatia-técnica com micrômetro manual | Stoelting Co. | 51425 | |
| Artista redondo 2/0’s escova | Princeton Art Brush | 4350R | |
| Harris Uni-Core, extrator de tecido (0,75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Harris Uni-Core, extrator de tecido (1,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15099 | |
| Harris Uni-Core extrator de tecido (1,5 mm) | Ted Pella, Inc. | 15075 | |
| Harris Uni-Core extrator de tecido (2,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15076 | |
| Guilhotina | Braintree Scientific, Inc. | RG-100 | |
| Decapicones | Braintree Scientific, Inc. | MDC-200 | |
| HyClone Earle’uma solução salina balanceada (EBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30029.02 | |
| Pipetas de 25 mL | Corning | 4489 | Livre de nucleases |
| epT.I.P.S. Ponteiras de pipeta LoRetention Dualfilter, 20 — 300 μL | Eppendorf | 0030 077.636 | |
| Tubos com tampa de rosca TrakMates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3741 | |
| Leitor sem fio de códigos de barras 2D VisionMate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3122MTX | |
| Leitor de código de barras 2D VisionMate SR com rack único | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3115 | |
| 1-200 μpontas de pipeta universais | Corning | 4864 | Livre de nucleases |
| Placas de cultura celular Cellstar | Greiner Bio-One | 628160 | Livre de nucleases |
| Placa de cultura tecidual Cellstar de poliestireno, fundo redondo, 96 poços, Greiner Bio-One | USA Scientific, Inc. | 5665-0180 | Livre de nucleases |
| #4 Papel de filtro | Whatman, GE Healthcare | 1004 150 | |
| Pipetador de segurança com bulbo de silicone | Fisher Scientific | 13-681-102A | |
| NanoDrop 3300 Espectrofotômetro | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-3300 |
Referências
- Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
- Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
- Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
- Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
- Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
- Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
- Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.
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Reimpressões e permissões
