CD4 + T-linfócitos Captura Usando um chip descartável microfluídicos para HIV

Protocolo

1. Prepare canais microfluídicos com anti-CD4 ⁺ biotinlayted superfície.
2. Injectar 10 ml de amostra de sangue de 5 ml / min no canal microfluídicos com bomba de seringa.
3. Lavar o sangue de 20 ml / min para 20 min com PBS.
4. Injectar a solução diluída de lise FACS (diluído a 10% da solução estoque com PBS) em 5ul/min por 15 min.
5. Incubar por 15 min.
6. Injetar CD3 ⁺ solução de anticorpos primários (diluído a 10% da solução estoque com PBS) a 5 ml / min para 20 min.
7. Incubar por 2 horas.
8. Lave canal com PBS, 5 ml / min para 15 min.
9. Injectar 20% AF488 CD4 ⁺ de anticorpos, solução estoque 0,2% DAPI, e 10% CD3 ⁺ anticorpo secundário a 5 ml / min para 20 min, ao mesmo tempo.
10. Incubar por 20 min.
11. Lave o canal com PBS, 5 ml / min para 15 min.
12. Contagem de células ao microscópio fluorescente:
    1. White (óptica) - Preto e branco: célula e poeira
    2. UV (DAPI) - Blue: única célula
    3. Azul (CD4 ⁺⁾ - Verde: linfócitos T e monócitos
    4. Verde (CD3 ⁺⁾ - Vermelho: linfócitos T só

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microcanal de PDMS				Fabricado por molde SU-8
Sangue				Sangue doado por indivíduo humano normal. Mass General Hospital, 10 X leucócitos de alta densidade ou Brigham and Women’s Hospital.
PBS	Tampão	Invitrogen	14190	Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco’s 1x.
Solução lisadora FACS		BD Biosciences	349202	Diluída a 10% da solução estoque com PBS.
Anticorpo biotinilado anti-CD4+		Beckman Coulter Inc.	IM0704	Superfície preparada com anticorpo biotinilado anti-CD4+, diluído a 10% da solução estoque com PBS/BSA após mistura com 0,2 mg do estoque e 1 ml de água desionizada.
anti-hCD3delta de cabra	pAB	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-1128	Diluído a 10% da solução estoque com PBS
IgG de cabra anti-coelho PE		Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-3755	Anticorpo secundário para anticorpo anti-CD3, diluído a 10% da solução estoque com PBS
anti-CD4+ humano		BD Biosciences	557695	Marcar com Alexa Fluor 488, diluído a 20% da solução estoque com PBS.
DAPI		Invitrogen	D1306	Solução de 4’,6-dianidino-2-fenilindol, di-hidrocloreto, diluída a 0,2% da solução estoque com PBS.