Encapsulation título celular por Droplets

Protocol

NIH3T3 preparação células:

Células de A. de ejeção

1. Trypsinize células, então diluir 1:1 com media de células, e transferência de um frasco T75 para um tubo Falcon 15 mL
2. Spin down células em um pellet por centrifugação, aspirar o sobrenadante e lavar as células com DPBS
3. Spin down células em uma pelota de novo, e aspirar o sobrenadante
4. Ressuspender as células em meios de comunicação
5. Determinar a densidade de células com hemocitômetro (~ 200 X 10 ⁴ células / mL por frasco T75)
6. Solução da célula centrífuga, aspirar o sobrenadante e ressuspender em quantidade adequada dos meios de comunicação para diferentes concentrações de células

B. Célula de ejeção

1. Vortex células antes de usar para a ejeção
2. Transferir 200 mL da solução de célula em seringa
3. Definir o modo apropriado no gerador de pulso
   1. Para ejetar gotículas de única e gotículas múltiplas (rajadas), grupo gerador de pulso para "E. BUR" modo
   2. Para a ejeção de gotas contínuo, grupo gerador de pulso para "NORM" modo de
4. Alterar as configurações de sinal
   1. Conjunto de alto nível e baixo nível de tensão de saída: LIS a 5 V e LOL para 0 V e certifique-se o "LIM" LED está ligado
   2. Definir como um sinal de pulso quadrado
   3. Alterar a quantidade de tempo que a válvula solenóide é aberta para a ejeção de gotas, alterando o valor para "WID" ou mudar ciclo ("dever")
   4. Mudar a freqüência de ejeção, alterando o valor para "PER"
   5. Alterar o número de gotículas ejetado em uma explosão, alterando o valor para "BUR"
5. Solução da célula ejetar em substrato preparado para imagens com microscópio

Coloração C.

1. Compõem solução corante com 0,5 mL calceína-AM e 2 homodímero de etídio mL por mL de DPBS
2. Substrato preparado mergulhe em solução corante
3. Deixar a amostra para incubar por 10 minutos a 37 ° C antes de imagem

Validação de experiência

1. Em um microscópio Nikon Eclipse TE U-2000 Fluorescent
   1. Software ponto avançado (Diagnostics, Inc.)
   2. Live / Morto Assay

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
	Fluorescente	Nikon Instruments	Eclipse TE-2000 U
			célula de válvula solenóide	Frequência de operação: 1 KHz, 30psi, 50nl~0.5ul. Driver de válvula 12V: corrente de acionamento de 2,5 Amp Tanque
	de ar portátil de 5 galões	Coleman	Powermate CT5	Ar pressurizado: 30 PSI
Reguladores de		Marsh Bellofram
Gerador			de pulso HP8112A	Geração de frequência de atuação: 50 MHz
	Newmark	de estágio		com motor de passo: estágio xy de curso de 6 polegadas (NLS4-6-25), estágio z de curso de 2,5 polegadas (NLS4-2,5-25), controlador de 3 eixos (NSC-G3), resolução de 0,1um
NIH 3T3	Fibroblastos	de linha
Tripsina				Solução a 0,05%
NIH 3T3 meio
DPBS	Buffer
T75				Frascos de cultura
			Tubos cônicos de plástico	15 ml, para cultura de tecidos