Uma técnica de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier para estudar a automontagem de peptídeos

Resumo

Fonte: Neves, R., et al. Síntese e caracterização de peptídeos de automontagem modificados com 1,2-dithiolane. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a automontagem de peptídeos amilóides em uma estrutura supramolecular rica em folha beta usando espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier. Um feixe infravermelho é passado através de um cristal com alto índice de refração e a absorção de energia através da interface do cristal e a amostra é registrada. As estruturas secundárias das proteínas da amostra são identificadas pela análise de seus picos de absorção característicos em regiões específicas do espectro infravermelho, o que ajuda a identificar a formação do conjunto supramolecular.

Protocolo

1. Caracterização de estruturas de automontagem supramoleculares

1. Formação de fibras amilóides
   1. Para preparar uma solução de automontagem, pesar 1 mg do pó de peptídeo usando uma balança analítica. Dissolva em uma mistura (pH 7,5) de 20% de acetonitrila e ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) 10 mM em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, até uma concentração final de 1 mg / mL de mistura de montagem de peptídeos. Vortex a solução de montagem e deixe-a montar em temperatura ambiente.
2. Caracterização espectroscópica de fibras amilóides
   1. Siga o processo de montagem do peptídeo por meio de espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) a cada poucos dias. Um pico amplo centrado em torno de 1670 ^cm-1 é a assinatura IR decorrente de peptídeos não montados na amostra. As amostras de montagem de peptídeos geralmente levam de uma a duas semanas para que o amplo pico desmontado desapareça e atinja a maturação.
      1. Secar uma alíquota de 8-10 μl da solução de montagem sob a forma de película fina sobre o cristal de diamante ATR. Monitore o desaparecimento de um pico de água grande e amplo de 1640 a 1630 ^cm-1 à medida que o filme seco se forma.
      2. Adquira espectros de infravermelho de 1500-1800 ^cm-1 com média de 50 varreduras com resolução de 2 ^cm-1. Adquira e subtraia as varreduras em segundo plano antes de cada varredura de amostra. A assinatura IR para montagem de β folha é um pico acentuado entre 1625 e 1635 ^cm-1 (Figura 1A).

Resultados

Figura 1. Caracterização supramolecular do peptídeo modificado com 1,2-ditilano. (A) FT-IR de 1 mg/mL de 1,2-ditiolano-KLVFFAQ-NH₂ fibras montadas em HEPES 10mM, pH 7,5 em 20% CH₃CN. O pico a 1627 ^cm-1 é consistente com os pe...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Acetonitrila	Fisher Scientific	A998-4	Inflamável; irritante para os olhos; Use equipamentos de proteção individual; Use apenas sob uma hotte; mantenha longe de chamas abertas ou superfícies quentes; se contatado enxágue com água por pelo menos 15 minutos e obtenha atendimento médico
Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanossulfônico	Acros Organics	AC172571000	Não inale; use ao ar livre ou em área bem ventilada
Espectrômetro infravermelho com transformada de Fourier	Alpha Tensor, Bruker