Method Article

Aplicação de um rato ligado patch Peyer Assay alça intestinal para avaliar absorção pelas células bacterianas M

DOI:

10.3791/3225

December 17th, 2011

In This Article

Summary

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Células M em um epitélio folículo-associados especializados que cobrem as placas de Peyer desempenhar um papel importante para a vigilância imunológica da mucosa intestinal em tecido linfóide associado. Aqui descrevemos o método de avaliação para transcitose bacteriana por células M In vivo. Este método proporciona um método para compreender a função das células M no sistema imunológico.

Abstract

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O interior do nosso intestino é habitado, com grande número de bactérias comensais. A superfície da mucosa do trato gastrointestinal é constantemente exposta a eles e, ocasionalmente, a patógenos. O tecido linfóide associado ao intestino (GALT) desempenham um papel fundamental para a indução da resposta imune da mucosa a estes micróbios 1, 2. Para iniciar a resposta imune da mucosa, os antígenos da mucosa devem ser transportados a partir da luz intestinal através da barreira epitelial em folículos linfóides organizados, tais como placas de Peyer. Este transcitose antígeno é mediada por células especializadas M epiteliais 3, 4. As células M são atípicos células epiteliais que fagocitam ativamente macromoléculas e micróbios. Ao contrário das células dendríticas (DCs) e macrófagos, antígenos que têm como alvo a lisossomos para degradação, as células M transcytose principalmente os antígenos internalizado. Este transcitose macromolecular vigorosa através de células M oferece antígeno ao subjacente organizado folículos linfóides umd acredita-se ser essencial para dar início antígeno específico da mucosa respostas imunes. No entanto, os mecanismos moleculares promover esta absorção de antígenos por células M são em grande parte desconhecido. Temos relatado anteriormente que glicoproteína 2 (GP2), especificamente expressos na membrana plasmática apical das células M entre os enterócitos, serve como um receptor transcytotic para um subconjunto de comensais e patogênicos enterobactérias, incluindo Escherichia coli e Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium ), ao reconhecer FimH, um componente do tipo I pili na membrana externa bacteriana 5. Aqui, apresentamos um método para a aplicação de um ensaio de Peyer rato ciclo de patch para avaliar a absorção intestinal de bactérias pelas células M. Este método é uma versão melhorada do ensaio de loop do mouse intestinal descrito anteriormente 6, 7. Os pontos de melhoria são as seguintes: 1. Isoflurano foi usado como um agente anestésico. 2. Aproximadamente 1 cm incluindo alça ligada intestinalremendo ing Peyer foi criada. 3. Bactérias absorvidas pelas células M foram marcados por fluorescente reagente rotulagem de fluorescência ou por superexpressão da proteína fluorescente como a proteína verde fluorescente (GFP). 4. Células M no epitélio folicular associada cobrindo mancha de Peyer foram detectadas por todo o monte immunostainig com o anticorpo anti Gp2. 5. Fluorescentes transcitose bacteriana por células M foram observados por análise microscópica confocal. Corrigir o Peyer rato ensaio de alça intestinal poderia fornecer a resposta que tipo de bactérias patogênicas ou comensais transcytosed pelas células M, e pode nos levar a entender o mecanismo molecular de como estimular o sistema imunológico da mucosa através de células M.

Protocol

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1. Preparação de células bacterianas

  1. Glicerol Streak abastecido bactérias fluorescentes (GFP como expressar S. Typhimurium) em uma placa de ágar LB contendo 100 mg / ml de ampicilina.
  2. Cultura colônia a partir de um único agar LB durante a noite em 2 ml de meio LB novo.
  3. Adicionar 0,5 ml de cultura bacteriana e 4,5 ml de meio LB e incubar novos até densidade óptica de 1,0 a 600 nm é atingido.
  4. Células bacterianas colheita por centrifugação (3.000 xg, 5 min, 4 ° C).
  5. Desprezar o sobrenadante e lavar duas vezes com 5,0 ml de solução salina estéril tampão fosfato (PBS).
  6. Ressuspender pellet de bactérias co....

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Discussion

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O tempo de incubação do patch Peyer ligada com suspensão bacteriana é geralmente para 1 hora de observar a incorporação de bactérias nas células M. Em caso de 4 horas de incubação, as bactérias são muitas vezes detectados na zona de células T de placas de Peyer. Como a anestesia inalatória com isoflurano vaporizado poderia manter ratos estável, o tempo de incubação do patch Peyer ligada com suspensão bacteriana é extensível para observar as bactérias que se movem em T-cell zona no patch de Peyer. O ponto important.......

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Disclosures

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Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

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Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do BEI para o desenvolvimento desta técnica. Esta pesquisa foi apoiada em parte por Grant-in-Aid para a Investigação Científica em Áreas Prioritárias "Traffic Membrane" (HO), e "Matriz de Fenômenos Infecciosas" (KH), Jovens Cientistas (SF e KH), e da Investigação Científica (HO ), Investigação Científica e em áreas inovadoras "Logística intracelular" (HO), do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nome do reagente Companhia Número de catálogo Comments (opcional)
LB Agar Ampicilina-
100
SIGMA L5667
Cy3 mono-Reativa
Pacote de corante
GE Healthcare PA23001
Alexa Fluor 350
ácido carboxílico,
succinimidyl ester
Invitrogen A10168
Anestesia inalatória
aparelho
Shinano Seisakusho SN-487
Fixação e
Permeabilização
Solução
BD 554722
Rato Anti
Glicoproteína 2
anticorpo
MBL D278-3 200 vezes de diluição (5μg/ml)
Goat Anti-IgG de rato,
F (ab ') 2 fragmento
específico
Jackson
ImmunoResearch
112-505-006 200 vezes de diluição (20μg/ml)
Alexa Fluor 633
Faloidina
Sondas moleculares A22284 50 vezes de diluição
Confocal a laser
microscópio de varredura
Leica Microsystems DMIRE2
DeltaVision
Restauração
deconvolução
microscópio
Precision aplicada DeltaVision Núcleo

References

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  1. Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
  2. Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Scienc....

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M CellsPeyer s PatchBacterial UptakeIntestinal Loop AssayConfocal MicroscopyGp2 AntibodyFluorescent BacteriaMucosal ImmunityStromal Vascular FractionCell Isolation

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