Monitoramento de mudanças na estrutura Equilibrium RNA por "peroxidativo" e "oxidativo" Footprinting Radical Hidroxila

Summary

Este protocolo descreve como quantificar o Mg (II) dependente da formação de RNA estrutura terciária através de dois métodos de pegada radical hidroxila.

Abstract

Moléculas de RNA desempenham um papel essencial na biologia. Além de transmitir a informação genética, RNA pode dobrar em exclusivo estruturas terciárias cumprindo um papel biológico específico como ligante regulador, ou catalisador. Informações sobre a formação de contato superior é essencial para compreender a função das moléculas de RNA. Radicais hidroxila (OH •) são sondas única da estrutura dos ácidos nucléicos, devido à sua alta reatividade e tamanho pequeno. ¹ Quando utilizado como uma sonda pegada, os radicais hidroxila mapa da superfície acessível solvente do backbone fosfodiéster do DNA e RNA ^{1 2} com tão fina como a resolução de nucleotídeo único. Footprinting radical hidroxila pode ser usado para identificar os nucleotídeos dentro de uma superfície de contato intermolecular, por exemplo, ^{DNA-proteína-1} e RNA-proteína complexos. Equilibrium ³ e ⁴ transições cinética pode ser determinada através da realização de pegada radical hidroxila em função de um solutina variável ou tempo, respectivamente. Uma característica fundamental da pegada é que a exposição limitada à sonda (por exemplo, 'single-hit cinética ") resulta na amostragem uniforme de cada nucleotídeo do polímero. ⁵

Neste artigo de vídeo, usamos o domínio P4-P6 da ribozima Tetrahymena para ilustrar RNA preparação de amostras e determinação de um (II) mediada por Mg isotermas de dobradura. Descrevemos a utilização do protocolo pegada bem conhecido radical hidroxila que requer H ₂ O ₂ (nós chamamos este protocolo "peroxidativo ') e um valor, mas não muito conhecido alternativa, que usa naturalmente O ₂ dissolvido (chamamos isso de" o protocolo oxidativo "). Uma visão geral da redução de dados, transformação e procedimentos de análise é apresentado.

Protocol

1. Preparação dos Reagentes Footprinting

1. Preparar um tampão de reação 10x, contendo 100 mM cacodilato de sódio, 1 mM EDTA, e 1 M KCl. Ajustar o pH para 7,4. Filtrar o tampão 0,2 mM usando um dispositivo de filtro de acetato (Nalgene). Observação: não pipeta RNA diretamente em tampão 10x.
2. Prepare a mistura de reacção de titulação para cada reação, como indicado na Tabela 1. O volume da mistura de titulação (1x buffer e Mg (II) na concentração desejada) deve ser de 90 mL, antes de adicionar 10μl de RNA em tampão 1x.
3. Preparar um tampão de digestão RNAse T1 contendo Uréia 6.63M, citrato de sódio 20mM, EDTA 1mM, 0,25 mcg / mL tRNA, cyanol xi....

Discussion

Footprinting radical hidroxila é uma ferramenta valiosa para avaliar a área de superfície acessível solvente de ácidos nucléicos. Formação qualitativa e quantitativa da estrutura terciária ¹⁴ pode ser seguido em função de parâmetros como tipo e concentração de íons, pH, temperatura, proteínas de ligação ou dobrar co-fatores. A combinação irresistível de um protocolo para a frente e de baixo custo e acessibilidade resultante de solvente e informações dobrar em um nível de nucleotídeo único torna este método mu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Empresa	Cat#
Cacodilo de Sódio (Cuidado! Tóxico)	Sigma-Aldrich	C4945-25g
EDTA (0,5 M)	Ambion	AM9260G
DEPC água tratada	Ambion	AM9915G
Acetato de Sódio (3 M)	Ambion	AM9740
MgCl < sub>2< / sub> (1 M)	Ambion	AM9530G
Ureia Ambion		AM9902
Sódio Citrato	Sigma-Aldrich	W302600
tRNA	Sigma-Aldrich	R-7876
Sódio-L-ascorbato	Sigma-Aldrich	A7631-25g
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O	Sigma-Aldrich	F1543-500g
RNase T1	Fermentas	EN0541
Peróxido de hidrogênio (30%)	Sigma-Aldrich	349887