Um procedimento simples de realizar experimentos de microarray personalizado microRNA é descrito. As etapas incluem isolar RNA, rotulagem RNA e DNA de referência, hibridação as amostras para microarrays, a digitalização da microarrays, quantificar e analisar os sinais de hibridização.
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Artigo de método
A realização de experimentos de Microarray personalizado MicroRNA
Neste artigo
Resumo
Resumo
microRNAs (miRNAs) são uma grande família de ~ 22 nucleotídeos (nt) longas moléculas de RNA, que são amplamente expressos em eucariotos 1. Genomas complexos codificam pelo menos centenas de miRNAs, que principalmente inibir a expressão de um vasto número de genes-alvo pós-transcricionalmente 2, 3. miRNAs controlam uma ampla gama de processos biológicos 1. Além disso, a expressão de miRNA alterados tem sido associado com doenças humanas como câncer e miRNAs podem servir como biomarcadores para doenças e prognóstico 4, 5. É importante, portanto, entender a expressão de miRNAs e funções sob diversas condições.
Três abordagens principais têm sido empregadas para expressão perfil de miRNA: real-time PCR, microarranjos, seqüenciamento e profunda. A técnica de microarray miRNA tem a vantagem de ser de alto rendimento, geralmente menos caro, ea maioria das etapas experimentais e análise pode ser carried em um laboratório de biologia molecular na maioria das universidades, as escolas médicas e hospitais associados. Aqui, nós descrevemos um método para a realização de experimentos de microarray miRNA personalizado. Um conjunto de sonda de miRNA serão impressas em lâminas de vidro para produzir microarrays miRNA. RNA é isolado usando um método ou reagente que preserva espécies de pequenos RNA, e então marcadas com um corante fluorescente. Como controle, oligonucleotídeos referência DNA correspondente a um subconjunto de miRNAs também estão marcadas com um corante fluorescente diferente. O DNA de referência servirá para demonstrar a qualidade do slide e hibridação e também será utilizado para a normalização de dados. O RNA e DNA são misturados e hibridizado com uma lâmina de microarray contendo sondas para a maioria dos miRNAs na base de dados. Após a lavagem, o slide é digitalizada para obter imagens e intensidades dos pontos individuais quantificadas. Esses sinais-prima será processada e analisada como os dados da expressão do miRNAs correspondente. Microaslides rray pode ser descascado e regenerado para reduzir o custo de microarrays e para reforçar a coerência das experiências microarray. Os mesmos princípios e procedimentos são aplicáveis a outros tipos de experimentos de microarray personalizado.
Protocolo
1. Impressão de microarrays miRNA personalizado
- Imprimir o microarray slides usando o microarray serviços instalação do núcleo de uma universidade ou uma empresa. A qualidade de microarray de fabricação é um dos fatores mais críticos para o sucesso de um experimento de microarray. Tente alguns serviços, se possível. Idealmente, seria imprimir 5-10 slides de cada vez, e todos os slides parecem idênticos, com bem separados, os pontos individuais.
- Para suporte microarray, usamos as lâminas GAPS II revestido.
- Para sondas de miRNA, usamos o nCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2.
- Dissolver todos os oligonucleotídeos em 3....
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Discussão
Apesar dos avanços recentes nas tecnologias de seqüenciamento de profundidade, microarray continua a ser uma opção viável para high-throughput análise de DNA e RNA. Comparado ao seqüenciamento de profundidade, as experiências microarray são mais baratos, e um laboratório de biologia molecular típico pode executar a maioria dos experimentos e análise de dados in-house, o que permite flexibilidade e economiza tempo. No futuro, é provável microarrays adequado para interrogar intensamente conjuntos de genes, por exemplo, to.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
O trabalho foi suportado em parte pelo Instituto Nacional de Abuso de Drogas Center (P50 DA 011.806) e Exército dos Estados Unidos Departamento de Defesa (W81XWH-07-1-0183).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Itens | Vendedor | Número de catálogo | Comentários |
| NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2 | Invitrogen | MIRMPS201 | Desenhado com base nos miRBase Release 9.0 (Outubro de 2006). Ele contém ~ 1140 sem modificações, 34-44 nt oligonucleotídeos longos como sondas para voar worm,, peixe-zebra, rato, rato, e miRNAs humanos, e um número de sondas de controle interno, como snoRNAs. As sondas de miRNA são doublets das seqüências complementares de miRNAs maduros, daí o tamanho de ~ 44 nt. Para a análise de um pode se concentrar em miRNAs de um genoma particular (s) de interesse. |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | Temos também utilizado enriquecido, fração de RNA pequeno de rotulagem, embora total de amostras de RNA são mais rápidos e mais fáceis de preparar e de quantificar e adequado para aplicações a jusante como a análise de mRNA. |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Ulysis Alexa Fluor 647 Kit Rotulagem de Ácido Nucleico | Invitrogen | U21660 | Este kit ou produtos similares podem ser usados para rotular amostras experimentais RNA ou um RNA de controlo (em vez de DNA de controle) também. |
| 5'-PCU-DY547-3 ' | Dharmacon | Feitos | Fração pequena do RNA pode ser igualmente marcada pela ligadura. |
| Colunas CentriSep | Separações Princeton | CS-901 | |
| GAPSII corrediça revestida | Corning | 40004 | Outros tipos de slides podem ser usados também. |
| Hibridização câmaras de microarray | Corning | 2551 ou 40080 | Outros tipos de câmaras de hibridação e lamínulas também deve funcionar. Utilização de máquinas de hibridização comercialmente disponíveis podem reduzir o tempo de hibridização significativamente, por exemplo, a ~ 2 horas. |
| Lifterslips | ThErmo / Erie Scientific | 25X60I-M5439-001-LS | |
| BlueFuse | BlueGenome | ||
| GeneSpring | Agilent |
Referências
- Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 431, 350-355 (2004).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2009).
- Chekulaeva, M., Filipowicz, W.
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Reimpressões e permissões
