A realização de experimentos de Microarray personalizado MicroRNA

Summary

Um procedimento simples de realizar experimentos de microarray personalizado microRNA é descrito. As etapas incluem isolar RNA, rotulagem RNA e DNA de referência, hibridação as amostras para microarrays, a digitalização da microarrays, quantificar e analisar os sinais de hibridização.

Abstract

microRNAs (miRNAs) são uma grande família de ~ 22 nucleotídeos (nt) longas moléculas de RNA, que são amplamente expressos em eucariotos ^1. Genomas complexos codificam pelo menos centenas de miRNAs, que principalmente inibir a expressão de um vasto número de genes-alvo pós-transcricionalmente ^{2, 3.} miRNAs controlam uma ampla gama de processos biológicos ^1. Além disso, a expressão de miRNA alterados tem sido associado com doenças humanas como câncer e miRNAs podem servir como biomarcadores para doenças e prognóstico ^{4, 5.} É importante, portanto, entender a expressão de miRNAs e funções sob diversas condições.

Três abordagens principais têm sido empregadas para expressão perfil de miRNA: real-time PCR, microarranjos, seqüenciamento e profunda. A técnica de microarray miRNA tem a vantagem de ser de alto rendimento, geralmente menos caro, ea maioria das etapas experimentais e análise pode ser carried em um laboratório de biologia molecular na maioria das universidades, as escolas médicas e hospitais associados. Aqui, nós descrevemos um método para a realização de experimentos de microarray miRNA personalizado. Um conjunto de sonda de miRNA serão impressas em lâminas de vidro para produzir microarrays miRNA. RNA é isolado usando um método ou reagente que preserva espécies de pequenos RNA, e então marcadas com um corante fluorescente. Como controle, oligonucleotídeos referência DNA correspondente a um subconjunto de miRNAs também estão marcadas com um corante fluorescente diferente. O DNA de referência servirá para demonstrar a qualidade do slide e hibridação e também será utilizado para a normalização de dados. O RNA e DNA são misturados e hibridizado com uma lâmina de microarray contendo sondas para a maioria dos miRNAs na base de dados. Após a lavagem, o slide é digitalizada para obter imagens e intensidades dos pontos individuais quantificadas. Esses sinais-prima será processada e analisada como os dados da expressão do miRNAs correspondente. Microaslides rray pode ser descascado e regenerado para reduzir o custo de microarrays e para reforçar a coerência das experiências microarray. Os mesmos princípios e procedimentos são aplicáveis ​​a outros tipos de experimentos de microarray personalizado.

Protocol

1. Impressão de microarrays miRNA personalizado

1. Imprimir o microarray slides usando o microarray serviços instalação do núcleo de uma universidade ou uma empresa. A qualidade de microarray de fabricação é um dos fatores mais críticos para o sucesso de um experimento de microarray. Tente alguns serviços, se possível. Idealmente, seria imprimir 5-10 slides de cada vez, e todos os slides parecem idênticos, com bem separados, os pontos individuais.
2. Para suporte microarray, usamos as lâminas GAPS II revestido.
3. Para sondas de miRNA, usamos o nCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2.
4. Dissolver todos os oligonucleotídeos em 3....

Discussion

Apesar dos avanços recentes nas tecnologias de seqüenciamento de profundidade, microarray continua a ser uma opção viável para high-throughput análise de DNA e RNA. Comparado ao seqüenciamento de profundidade, as experiências microarray são mais baratos, e um laboratório de biologia molecular típico pode executar a maioria dos experimentos e análise de dados in-house, o que permite flexibilidade e economiza tempo. No futuro, é provável microarrays adequado para interrogar intensamente conjuntos de genes, por exemplo, to.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Itens	Vendedor	Número de catálogo	Comentários
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Desenhado com base nos miRBase Release 9.0 (Outubro de 2006). Ele contém ~ 1140 sem modificações, 34-44 nt oligonucleotídeos longos como sondas para voar worm,, peixe-zebra, rato, rato, e miRNAs humanos, e um número de sondas de controle interno, como snoRNAs. As sondas de miRNA são doublets das seqüências complementares de miRNAs maduros, daí o tamanho de ~ 44 nt. Para a análise de um pode se concentrar em miRNAs de um genoma particular (s) de interesse.
Trizol	Invitrogen	15596018	Temos também utilizado enriquecido, fração de RNA pequeno de rotulagem, embora total de amostras de RNA são mais rápidos e mais fáceis de preparar e de quantificar e adequado para aplicações a jusante como a análise de mRNA.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Kit Rotulagem de Ácido Nucleico	Invitrogen	U21660	Este kit ou produtos similares podem ser usados ​​para rotular amostras experimentais RNA ou um RNA de controlo (em vez de DNA de controle) também.
5'-PCU-DY547-3 '	Dharmacon	Feitos	Fração pequena do RNA pode ser igualmente marcada pela ligadura.
Colunas CentriSep	Separações Princeton	CS-901
GAPSII corrediça revestida	Corning	40004	Outros tipos de slides podem ser usados ​​também.
Hibridização câmaras de microarray	Corning	2551 ou 40080	Outros tipos de câmaras de hibridação e lamínulas também deve funcionar. Utilização de máquinas de hibridização comercialmente disponíveis podem reduzir o tempo de hibridização significativamente, por exemplo, a ~ 2 horas.
Lifterslips	ThErmo / Erie Scientific	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent