Utilização do Modelo EpiAirway para caracterizar a longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno

Resumo

Este método permite a caracterização de bactérias estendida co-cultura com EpiAirways primário, o tecido epitelial respiratório humano cresceu na interface ar-líquido, uma biologicamente relevantes In vitro. A abordagem pode ser usada com qualquer micróbio que é passível de longo prazo co-cultura.

Resumo

Haemophilus influenzae não tipáveis ​​(NTHi) são adaptadas aos humanos bactérias Gram-negativas que podem causar infecções recorrentes e crônica da mucosa respiratória ^{1, 2.} Para estudar os mecanismos pelos quais estes organismos sobrevivem e no interior dos tecidos respiratórios, um modelo no qual sucesso a longo prazo co-cultura de bactérias e células humanas pode ser realizado é necessária. Usamos principal respiratório humano tecidos epiteliais elevado à interface ar-líquido, o modelo EpiAirway (Mattek, Ashland, MA). Estes não são imortalizados, bem diferenciado, 3-dimensional tecidos que contêm tight junctions, células ciliadas e nonciliated, células caliciformes que produzem mucina, e manter a capacidade de produzir citocinas em resposta à infecção.

Este biologicamente relevantes modelo in vitro das vias aéreas superiores humanos, pode ser usado em uma série de maneiras, o objetivo geral deste método é a realização de longo prazo co-cultura de tecidos EpiAirway com NTHi e quantificar células associadas bactérias e internalizado ao longo do tempo . Assim, a produção de mucina e do perfil de citocinas dos infectados co-culturas pode ser determinada. Esta abordagem melhora a métodos existentes, em que muitos protocolos atuais usam culturas submersas monocamada ou Transwell de células humanas, que não são capazes de suportar as infecções bacterianas durante longos períodos ^3. Por exemplo, se um organismo pode replicar na mídia sobrejacente, isso pode resultar em níveis inaceitáveis ​​de citotoxicidade e perda de células do hospedeiro, prendendo o experimento. O modelo EpiAirway permite a caracterização de longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno. Além disso, desde a origem para a EpiAirway é humano normal tráqueo-brônquica células, em vez de uma linha imortalizada, cada um é uma excelente representação do real tecidos do trato respiratório superior humano, tanto na estrutura como na função ^4.

Para este método, os tecidos são desmamados EpiAirway off de compostos anti-microbial e anti-fúngicos por 2 dias antes da entrega, e todos os procedimentos são realizados sob condições livre de antibióticos. Isto requer considerações especiais, já que ambas as bactérias e primário tecidos humanos são usados ​​na cabine de segurança biológica mesmo, e são co-cultivadas por longos períodos.

Protocolo

1. Preparando o gabinete de biossegurança para os tecidos EpiAirway

1. Vestindo um casaco de laboratório dedicado, com o cabelo amarrado para trás e luvas, iniciar o fluxo laminar. Após 5 minutos, mover todas as ferramentas no armário (pipetadores, dicas, tubos de centrífuga, etc) para um lado, pulverizar o interior do armário de biossegurança ea faixa com etanol 70% e limpar com toalhas de papel limpo. Pulverizar o interior limpo novamente com etanol 70% e deixar secar. Mover as ferramentas para o lado limpo e repita o procedimento de etanol.
2. Use dicas barreira de aerossol pipeta e pipetadores no gabinete. Para utilizar individualmente embrulhados estéril pipetas sorológicas, passar o fim conectado através do fluxo laminar, quebrar, e deslize a pipeta no gabinete, descartando a parte externa da embalagem.
3. As pastilhas EpiAirway devem ser manipulados com pinças esterilizadas. Lugar de 6 polegadas ponta fina curva dissecar forceps em bolsas auto-selante de esterilização e autoclave. Prepare o suficiente para ter, pelo menos, seis dias por pronto para uso.

2. Desembalar os tecidos EpiAirway

1. Pulverizar a superfície de trabalho no gabinete de biossegurança com etanol 70% e limpar com toalhas de papel limpo. Pintar novamente e deixe a superfície secar antes de usar. Abrir a caixa de EpiAirway e descartar o isopor e material de embalagem.
2. O EpiAirway mídia livre de antibióticos, manutenção AIR-100-MM ABF (MM), é propriedade da Mattek e é enviado no kit com as inserções. No armário de biossegurança, etiqueta seis tubos de centrífuga estéreis 50 ml com o tipo de mídia e data, e afrouxar as tampas. Pulverizar a garrafa de mídia com etanol 70% e abrir dentro do armário. Alíquota de 25 ml de MM em cada tubo utilizando uma pipeta estéril nova sorológicos para cada tubo, aperte as tampas, e armazenar a 4 ° C. Use uma nova porção da MM a cada dia.
3. Repita 2.2 usando uma garrafa fresca de 1 X Dulbecco tampão fosfato (D-PBS) com cálcio e magnésio. Repita novamente usando D-PBS sem cálcio e magnésio. Armazenar todas as alíquotas a 4 ° C.
4. As pastilhas EpiAirway AIR-100 chegar em uma placa de 24 poços a 4 ° C em meios contendo sólidos agarose, e deve ser colocado em 6 bem-placas para uso. Etiquetar cada placa com a data ea descrição usando um marcador de etanol-resistente. Mililitro coloque 1 de 4 MM EpiAirway ° C em cada poço. Remova a placa de transporte de sua embalagem, spray com etanol 70%, e colocar no gabinete de biossegurança. Remova a fita e abra a placa. Utilizando uma pinça esterilizada, retire a gaze umedecida sobre as inserções EpiAirway.
5. Pegue uma inserção com uma pinça autoclavado usando um movimento de torção para ajudar na liberá-lo do agarose, e coloque em um poço de uma placa de 6 poços. Alguns agarose podem aderir ao inserir, particularmente quando a temperatura da placa de transporte aumenta a temperatura ambiente. Use um cotonete estéril para remover cuidadosamente a agarose a partir da inserção. Evite tocar a membrana, e verifique se não existem bolhas de ar ficam presos embaixo da inserts. Coloque a placa em um umidificado 37 ° C incubadora com 5% de CO _2.
6. Permitir que pelo menos 24 horas para os tecidos para equilibrar na incubadora antes de iniciar co-culturas.

3. Manutenção dos tecidos EpiAirway

1. Utilizando uma pinça esterilizada, pegar uma inserção e gentilmente pipeta 200 microlitros de pré-aquecido D-PBS com cálcio e magnésio para o tecido e rock a inserção. Incline a inserir em um ângulo e coloque a ponta da pipeta estéril P1000 contra o anel de plástico que contém a membrana na parte inferior da pastilha. Não toque no tecido. Aspirar o D-PBS lavar e colocar em um cryovial rotulados estéril. As amostras podem ser congeladas a -20 ° C e analisadas para mucina e / ou expressão de citocinas em uma data posterior.
2. Mudar o MM basal diariamente por aspiração e substituir por um mililitro de MM fresco. Use uma ponteira de pipeta nova barreira para cada poço. Tratar o material usado com água sanitária a 10% durante a noite e de descarte.

4. Inoculação de tecidos EpiAirway

1. Expelido de uma cultura fresca de Haemophilus influenzae não tipáveis ​​(NTHi) do estoque de glicerol congelados em ágar chocolate. Crescer durante a noite em um umidificado 5% incubadora de CO _2.
2. No dia seguinte, ressuspender colônias única de NTHi em pré-aquecido D-PBS com cálcio e magnésio para um OD (600 nm) de aproximadamente 0,7. Vortex vigorosamente antes de medir a densidade óptica. A relação da densidade óptica de unidades formadoras de colônia por mililitro (UFC / ml) de NTHi é que um OD (600 nm) de 0,2 é aproximadamente igual 1,0 x 10 ⁸ UFC / ml. Portanto, um OD (600 nm) de 0,7 é cerca de 3,5 x 10 ⁸ UFC / ml. Este algoritmo deve ser validado para cada cepa NTHi antes da inoculação.
3. Os tecidos EpiAirway AIR-100 são cultivadas em inserções com uma superfície de 0,6 cm ² e 0,4 micron uma membrana. Os tecidos são compostos de aproximadamente 8,0 x 10 ⁵ a ~ 1,0 x 10 ^{6 <}/ Sup células>. Portanto, uma inoculação de 1,0 x 10 ⁷ UFC corresponde a uma multiplicidade de infecção de cerca de 10 - 12. Para inocular, lavar cada inserção EpiAirway como no 3.1, em seguida, adicionar 28 microlitros da suspensão bacteriana preparada em 4.2 para a superfície apical de cada inserção EpiAirway no gabinete de biossegurança. Não inocular o MM basal. Retorno de cada placa para a incubadora.

5. Quantificação do inóculo NTHi

1. Preparar um tampão fosfato solução (PBS) com 0,1% de gelatina (PBS-G) autoclave, para esterilizar. Rótulo estéril de 1,5 ml tubos Eppendorf com as diluições 1:10 desejado baseado no OD (600 nm) do inóculo e alíquota 900 microlitros da PBS estéril-G em cada tubo.
2. Determinar o número de placas de chocolate agar necessário para enumerar os NTHi inoculados. Colocar essas placas em uma incubadora de ar de cabeça para baixo com a parte inferior da placa de descanso na metade da parte superior de uma hora. Isso permitirá que a placa para tanto quente a 37 ° C e secar a superfície, facilitando a queda de placas de NTHi.
3. Iniciar a diluições em série 1:10 do inóculo adicionando 100 microlitros da suspensão bacteriana de 4,2 para o primeiro tubo. Vortex cada diluição vigorosamente durante 5 segundos antes de fazer o próximo. Queda de 10 alíquotas microlitro sobre os pratos de agar pré-aquecido e superfície seca chocolate, usando a metade da placa para cada diluição. Cinco a seis alíquotas de 10 microlitros pode caber em uma metade de cada placa de 100 mm sem correr juntos. Ao local seco, de cabeça para baixo em um 37 ° C umidificado incubadora de CO ₂ durante a noite.
4. No dia seguinte, determinar o UFC / ml, contando as diluições que têm 15-30 colônias distintas em cada gota e cálculo de volta ao seu real inóculo viável de NTHi.

6. Longo prazo co-cultura com NTHi

1. A cada 24 horas, lavar as inserções como em 3.1, então o pool de lavagens de cada tecido que tenha sido inoculados com a mesma cepa de bactérias e congelar a -20 ° C em um cryovial rotulados para análise futura. Essas amostras podem ser analisadas para a presença de mucina por dot blots ou para a expressão de citocinas por ELISA. Alternativamente, os tecidos podem ser colhidas para mRNA e qPCR pode ser executada em genes de interesse. Mudar o MM basal diária como em 3.2. Continue para a duração da co-cultura.

7. Colheita de tecidos EpiAirway

1. Prepare uma nova solução de 1% de saponina em D-PBS sem cálcio e magnésio, filtro de esterilizar e quente a 37 ° C.
2. Aquecer um tubo de 50 ml de MM e outro de D-PBS sem cálcio e magnésio a 37 ° C.
3. Prepare os tubos de diluição como em 5.1, bem como um vazio estéril de 1,5 ml por tubo Eppendorf de inserção, marcado com o número de inserção e tensão NTHi.
4. O EpiAirways podem ser colhidas para qualquer total de associados a células de bactérias, que inclui tanto os organismos aderentes e internalizada, ou para as bactérias internalizadas apenas.
5. Determinar o número de placas de ágar chocolate necessária para soltar placa da célula associada ou invadido NTHi, rotular e secar por uma hora em uma incubadora de ar como em 5.2.
6. A colheita total associados a células de bactérias, lavar a superfície apical da EpiAirways três vezes com 200 microlitros de D-PBS sem cálcio ou magnésio, em seguida, incline a inserção e enxaguar qualquer MM remanescentes da membrana basal. A primeira lavagem pode ser congelado para posterior análise; descartar as lavagens seguintes.
7. Coloque a inserção lavados em uma placa de 6-bem fresca sem MM, e pipetar 250 microlitros da solução de 1% estéril saponina de 7,1 sobre a superfície apical de cada tecido. Voltar para a incubadora por 10 minutos.
8. Remover da incubadora, e usando uma ponteira de pipeta estéril P1000, esfrega os tecidos da membrana usando um back-e-vem, seguido por um movimento circular para remover o tecido das bordas da pastilha. Usando um grande furo ponteira estéril P1000, coloque a suspensão no tubo vazio marcado preparadas em 7.3. Adicione 250 microlitros de D-PBS sem cálcio ou magnésio na superfície apical da inserção.
9. Examinar a inserção utilizando um microscópio de contraste de fase invertido para determinar se há qualquer tecido remanescente a ser colhida. Se necessário, esfregue novamente com outra ponta da pipeta estéril P1000, em seguida, adicione esta suspensão para o tubo de 7,8 usando um grande furo ponteira estéril P1000. Trazer o volume total do tubo para 1 mililitro usando D-PBS sem cálcio ou magnésio.
10. Vortex vigorosamente a suspensão de células em alta velocidade por um minuto. Usando uma seringa estéril 1 ml com agulha calibre 26, aspirar a suspensão para a seringa através da agulha. Lentamente passa a suspensão através da agulha 3 vezes, tomando cuidado para não criar bolhas. Vortex vigorosamente de novo durante um minuto.
11. Usando um grande furo ponta da pipeta, coloque 100 microlitros da suspensão para dentro do tubo de diluição preparado pela primeira vez em 7.3. Vortex vigorosamente durante cinco segundos, em seguida, fazer diluições em série 1:10. Queda da placa-as diluições desejadas sobre a superfície seca placas de ágar-chocolate.
12. Para colher as bactérias internalizadas apenas, lave cada inserção 3 vezes com 200 microlitros de D-PBS sem cálcio ou magnésio. Reter e congelar a primeira lavagem. Adicionar sulfato de gentamicina para pré-aquecido MM a uma concentração final de 100 microgramas / ml. Prepare 1,5 ml de mídia por inserir a ser colhida. Substituir o MM basal com o MM contendo gentamicina, e adicionar 300 microlitros de gentamicina contendo MM na superfície apical. Coloque a placa de volta para a incubadora de CO ₂ por uma hora.
13. Remover o MM gentamicina contendo a partir da superfície apical e lavar a superfície apical ea membrana basal da inserção extensivamente com pré-aquecido D-PBS sem cálcio e magnésio. Proceder como no 7,7-7,11.

8. Resultados representativos:

Eletromicrografias de varredura da (A.) tecido EpiAirway não infectados e (B.) tecido após a 5 dias de co-cultura com NTHi são mostrados na Figura 1. Longo prazo co-cultura com NTHi não resulta em danos significativos à apical tecidos, ressaltando a utilidade do modelo EpiAirway. Um gráfico mostrando o número de bactérias internalizadas quantificados ao longo do tempo dentro de tecidos é mostrado na Figura 2. Ambos os resultados são bastante reprodutível, tornando os tecidos EpiAirway uma consistente e biologicamente relevantes modelo in vitro das vias aéreas superiores humanos para estudar NTHi Hospedeiro-Patógeno interações.

Figura 1. Microscopia eletrônica de varredura de tecidos EpiAirway. A. tecido controle não infectado. B. Tissue após cinco dias de co-cultura com NTHi. Sem danos significativos à superfície apical é observada nos tecidos infectados.

Figura 2. Número de NTHi internalizadas ao longo do tempo durante EpiAirway co-cultura. Strain R2866 foi inoculado em aproximadamente 1,0 x 10 ⁷ UFC / insert (Dia 0), então colhidas para as bactérias internalizadas em cada momento indicado. Barras representam n = 3 repetições em pelo menos duplicado. Barras de erro são SD.

Discussão

Este método permite a investigação de longo prazo interações patógeno-hospedeiro em um fundo biologicamente relevantes do ensino primário humana tecidos respiratórios na interface ar-líquido. Aqui nós temos utilizado NTHi como o organismo infectante, mas a interação de qualquer bactéria que não apresenta citotoxicidade inaceitáveis ​​ao longo do tempo pode ser quantificado com este método. O modelo EpiAirway também pode ser usado para o estudo de vírus, drogas ou produtos químicos que afetam as vias aéreas superiores hu...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Catálogo #	Comentários
Saponina	Calbiochem	558255-25GM	1% em D-PBS sem cálcio ou magnésio, filtro de esterilizar
1 X Dulbecco tampão fosfato com cálcio e magnésio	Lonza	17-513Q
1 X Dulbecco tampão fosfato sem cálcio ou magnésio	Lonza	17-515Q
EpiAirway livre de antibióticos tecidos	Mattek	AIR-100-ABF
EpiAirway antibióticos de mídia livre de manutenção	Mattek	AIR-100-MM-ABF	Fornecido com kit
Tampão fosfato 10X solução salina	EMD	6506	Diluir para 1X antes de usar
Gelatina	JT Baker	2124-01	Adicionar a uma concentração final de 0,1% em PBS 1 X e autoclave
Difco Base de Dados de Medium GC (ágar chocolate)	VWR	90002-016	Autoclave 36 g em 500 ml DDH 2 O e arrefecer a 60 ° C
BBL Hemoglobina (ágar chocolate)	VWR	90000-662	Autoclave 10 g em 500 ml 2 O DDH, arrefecer até 60 ° C e misturar com a base média GC acima
BD BBL enriquecimento IsoVitaleX (ágar chocolate)	VWR	90000-414	Esfriar a mistura de GC base de médio e hemoglobina para 55 ° C e adicionar 10 ml de IsoVitaleX reidratados, despeje o chocolate placas de ágar
Pinças de dissecação, ponta fina, curvada	VWR	82027-406
Auto-selante malotes da esterilização	VWR	89140-802
Gentamicina, sulfato 10 mg / ml	Lonza	17-519Z	Adicionar 10 microlitros / ml para MM EpiAirway para o matar gentamicina