Utilização do Modelo EpiAirway para caracterizar a longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno

Resumo

Este método permite a caracterização de bactérias estendida co-cultura com EpiAirways primário, o tecido epitelial respiratório humano cresceu na interface ar-líquido, uma biologicamente relevantes In vitro. A abordagem pode ser usada com qualquer micróbio que é passível de longo prazo co-cultura.

Resumo

Haemophilus influenzae não tipáveis ​​(NTHi) são adaptadas aos humanos bactérias Gram-negativas que podem causar infecções recorrentes e crônica da mucosa respiratória ^{1, 2.} Para estudar os mecanismos pelos quais estes organismos sobrevivem e no interior dos tecidos respiratórios, um modelo no qual sucesso a longo prazo co-cultura de bactérias e células humanas pode ser realizado é necessária. Usamos principal respiratório humano tecidos epiteliais elevado à interface ar-líquido, o modelo EpiAirway (Mattek, Ashland, MA). Estes não são imortalizados, bem diferenciado, 3-dimensional tecidos que contêm tight junctions, células ciliadas e nonciliated, células caliciformes que produzem mucina, e manter a capacidade de produzir citocinas em resposta à infecção.

Este biologicamente relevantes modelo in vitro das vias aéreas superiores humanos, pode ser usado em uma série de maneiras, o objetivo geral deste método é a realização de longo prazo co-cultura de tecidos EpiAirway com NTHi e quantificar células associadas bactérias e internalizado ao longo do tempo . Assim, a produção de mucina e do perfil de citocinas dos infectados co-culturas pode ser determinada. Esta abordagem melhora a métodos existentes, em que muitos protocolos atuais usam culturas submersas monocamada ou Transwell de células humanas, que não são capazes de suportar as infecções bacterianas durante longos períodos ^3. Por exemplo, se um organismo pode replicar na mídia sobrejacente, isso pode resultar em níveis inaceitáveis ​​de citotoxicidade e perda de células do hospedeiro, prendendo o experimento. O modelo EpiAirway permite a caracterização de longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno. Além disso, desde a origem para a EpiAirway é humano normal tráqueo-brônquica células, em vez de uma linha imortalizada, cada um é uma excelente representação do real tecidos do trato respiratório superior humano, tanto na estrutura como na função ^4.

Para este método, os tecidos são desmamados EpiAirway off de compostos anti-microbial e anti-fúngicos por 2 dias antes da entrega, e todos os procedimentos são realizados sob condições livre de antibióticos. Isto requer considerações especiais, já que ambas as bactérias e primário tecidos humanos são usados ​​na cabine de segurança biológica mesmo, e são co-cultivadas por longos períodos.

Protocolo

1. Preparando o gabinete de biossegurança para os tecidos EpiAirway

1. Vestindo um casaco de laboratório dedicado, com o cabelo amarrado para trás e luvas, iniciar o fluxo laminar. Após 5 minutos, mover todas as ferramentas no armário (pipetadores, dicas, tubos de centrífuga, etc) para um lado, pulverizar o interior do armário de biossegurança ea faixa com etanol 70% e limpar com toalhas de papel limpo. Pulverizar o interior limpo novamente com etanol 70% e deixar secar. Mover as ferramentas para o lado limpo e repita o procedimento de etanol.
2. Use dicas barreira de aerossol pipeta e pipetadores no gabinete. Para utilizar individualmente embrulhados ....

Discussão

Este método permite a investigação de longo prazo interações patógeno-hospedeiro em um fundo biologicamente relevantes do ensino primário humana tecidos respiratórios na interface ar-líquido. Aqui nós temos utilizado NTHi como o organismo infectante, mas a interação de qualquer bactéria que não apresenta citotoxicidade inaceitáveis ​​ao longo do tempo pode ser quantificado com este método. O modelo EpiAirway também pode ser usado para o estudo de vírus, drogas ou produtos químicos que afetam as vias aéreas superiores hu.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Catálogo #	Comentários
Saponina	Calbiochem	558255-25GM	1% em D-PBS sem cálcio ou magnésio, filtro de esterilizar
1 X Dulbecco tampão fosfato com cálcio e magnésio	Lonza	17-513Q
1 X Dulbecco tampão fosfato sem cálcio ou magnésio	Lonza	17-515Q
EpiAirway livre de antibióticos tecidos	Mattek	AIR-100-ABF
EpiAirway antibióticos de mídia livre de manutenção	Mattek	AIR-100-MM-ABF	Fornecido com kit
Tampão fosfato 10X solução salina	EMD	6506	Diluir para 1X antes de usar
Gelatina	JT Baker	2124-01	Adicionar a uma concentração final de 0,1% em PBS 1 X e autoclave
Difco Base de Dados de Medium GC (ágar chocolate)	VWR	90002-016	Autoclave 36 g em 500 ml DDH 2 O e arrefecer a 60 ° C
BBL Hemoglobina (ágar chocolate)	VWR	90000-662	Autoclave 10 g em 500 ml 2 O DDH, arrefecer até 60 ° C e misturar com a base média GC acima
BD BBL enriquecimento IsoVitaleX (ágar chocolate)	VWR	90000-414	Esfriar a mistura de GC base de médio e hemoglobina para 55 ° C e adicionar 10 ml de IsoVitaleX reidratados, despeje o chocolate placas de ágar
Pinças de dissecação, ponta fina, curvada	VWR	82027-406
Auto-selante malotes da esterilização	VWR	89140-802
Gentamicina, sulfato 10 mg / ml	Lonza	17-519Z	Adicionar 10 microlitros / ml para MM EpiAirway para o matar gentamicina