Summary
Basophil 인증 테스트 IGE에 의존 알레르기의 탐지를위한 강력한 도구입니다
Abstract
propyphenazone (PP)와 diclofenac (DF)와 같은 비 steroidal 항염증성 약물 (NSAIDs)에 대한 과민성 반응은 알레르기 반응 하나 I - 같은 유형 매니 페스트 수 있습니다. 피부 테스트는 신뢰성이되지 않고 구두 도발 시험은 환자 2 생명을 위협하는 위험을 저승으로 임상 연습에서 약물 과민성의 진단은 주로 환자의 역사에 의해 수행됩니다. 따라서, 기본 IGE - 중재 pathomechanism에 대한 증거는 얻을 수 어렵습니다.
여기, 우리는 생체내에 알레르기 반응을 모방 이펙터 약물 과민 환자에서 파생된 인간 basophils의 사용에 따라 체외 방식에 제시. 약물 알레르기 환자의 basophils는 범인의 약물에 대한 IGE 분자가 특정 휴대으로, 그들은 IGE 수용체 crosslinking에 활성화되고 알레르기 이펙터 분자를 릴리스된다. basophils의 활성화는 유동세포계측법 3을 사용 CD63 표면 표현의 upregulation의 결정에 의해 모니터할 수 있습니다.
낮은 분자량의 약물의 경우, conjugates은 basophils에서 IGE 수용체 crosslinking을 사용하도록 설계되었습니다. 그림 1, NSAIDs의 두 대표에 묘사된, PP와 DF는 covalently 리신 잔류물의 기본 아미노 그룹과 반응 카르 복실 그룹을 통해 (HSA) 인간 혈청 알부민에 바인딩됩니다. 카르 복실 그룹이 포함된 PP의 파생은 organochemically 사전 연구 1 합성이 분명해 반면, DF는, 따라서 직접 사 사용할 수있는 고유 카르 복실 그룹과를 수행합니다.
단백질 캐리어 분자에서 낮은 분자량 화합물과 그 공간적 분포의 결합 정도는 두 IGE 수용체 분자의 crosslinking을 보장하는 것이 중요합니다. 여기에서 설명한 프로토콜은 순차적 굴절률 (RI)와 울트라 바이올렛 (UV) 커플링 학위 결정에 대한 감지 시스템이 장착된 고성능 크기 제외 크로마 토그래피 (HPSEC)을 적용합니다.
설명 방법론이 다른 약물에 대해 적용될 수 있습니다으로서, basophil 인증 시험 (BAT)는 약물 과민성의 IGE - 중재 메커니즘의 결정에 사용될 수있는 잠재력을 맺는다. 여기, 우리는 IGE - 중재와 DF의 과민성 BAT에 의해 비 IGE - 중재만큼 PP 과민성을 결정합니다.
Protocol
1. 약물 conjugates의 준비
- 1.5 ML 반응 관에서 10 MG DF 1 ML DH 2 O의를 해산. 더 이상 진행이 DF 솔루션의 95 μl를 사용합니다. 로 활용하기 위해 PP HSA 500 μl 0.3 M의 수산화 나트륨 (NaOH)의 30.4 MG PP 유도체 (304g / 몰)를 해산.
- (N - morpholino) ethanesulfonic 산성 (MES) 버퍼 산도 해산 DF의 6.5-95 μl - 430.6 μl DH 2 O 100 μl 0.5 M 2를 추가합니다. 33.1 μl DH 2 O와 PP 예제 2 M MES 버퍼 산도 2.9 140 μl를 추가합니다.
- 신선한 N - 에틸 - N '의 57.5 μl를 추가 - (3 - 디메틸 아미노) MG / ML DF 샘플 100의 농도, 또는 10 μl EDC 솔루션과 함께 DH 2 O에 녹아있는 carbodiimide 하이드로 클로라이드 (EDC) 재고 솔루션을 PP 샘플. 소용돌이 1 분 샘플.
- 각 샘플에 118 MG / ML의 농도와 HSA 솔루션의 16.9 μl를 추가합니다.
- 300 라운드 / 분 동안 흔들어 상온에서 2 시간 동안 샘플을 품어.
- 몇 시간마다 인산 버퍼 식염수 (PBS) 산도 7.4 2 리터에 대항하는 DF와 PP 샘플 3 번 Dialyze. 4 ° C.에있는 모든 dialyzing 단계를 수행하여
- 14,000 XG에서 샘플 10 분 원심하여 뜨는 포함된 DF 또는 HSA에 복합 PP를 수집합니다.
- 12 % 젤을 사용하여 SDS - PAGE를 수행하여 단백질을위한 뜨는을 확인합니다. 한 겔 슬롯에 HSA 공액 12 μg에 대한로드합니다.
2. 약물 conjugates의 결합 비율 (그림 2)를 결정
- HPSEC에 의해 DF와 PP conjugates의 결합 률의 분석 150 MM NaCl 및 0.05 % 나트륨 azide를 포함한 100 MM 나트륨 인산염 버퍼 산도 6.5를 사용합니다. 쯧 - 겔 - G2000 SWXL 칼럼 mm 7.8 X 300을 사용합니다.
- 온라인 결합 RI 및 UV 검출기 시스템을 사용하여 신호의 감지를 수행합니다.
- DH 2 O. 1 MG / ML의 농도와 HSA 표준 샘플을 준비 검출기 보정 50 μl HSA 표준 솔루션을 주입.
- RI 상수 K의 RI 및 검출기에 대한 UV 상수 K의 UV를 계산합니다. 수식 영역 RI를 사용 = K의 RI * [(DN / DC) HSA * C (HSA)] 지역 UV = K UV * [(DA / DC) HSA * C (HSA)]와 함께 (DN / DC) HSA = 0.185과 (DA / DC) HSA = 0.518 5.
- DF 두 표준의 5, 10, 30 nmol 금액이 쉽게 주입 수 HPSEC에 대한 PP 파생 표준을 준비합니다.
- 약물과 두 표준 (DA / DC) 약물 (DN / DC)의 값을 의미 계산합니다. DF, (DN / DC) 0.235의 39.000의 ± 0.010과 (DA / DC) ± 0.493 결정한다고 들었습니다. PP 들어, 0.328 ± 0.016의 (DN / DC)와 (DA / DC) 53.155 ± 2.464의 대부분이 결정되었다.
- HPSEC에 약물 conjugates를 주사하고 RI 및 UV 피크 영역을 결정합니다.
- = K의 RI * [(DN / DC) 약물 * C (약) + (DN / DC) HSA * C (HSA)] 지역의 UV 두 방정식 영역 RI를 해결하여 DF, PP 유도체 및 HSA의 농도를 계산 = K UV * [(DA / DC) 약물 * C (약) + (DA / DC) HSA * C (HSA)] 신원 미상하십시오.
3. 약물 conjugates를 사용하여 BAT
- 일곱 유동세포계측법의 튜브를 준비하고 자신의 콘텐츠에 따라 그들을 분류 : 흠없는 제어, 음성 제어, 긍정적인 제어 및 약물 conjugates 있습니다.
- 피펫 흠없는과 부정적인 제어를위한 소유 유리병에 B - CCR - STB의 자극 버퍼 (Flow2 CAST, Bühlmann 연구소, Schönenbuch, CH) 50 μl. 긍정적인 컨트롤로 Flow2 CAST 키트에서 제공하는 안티 FcεRI 솔루션의 50 μl를 사용합니다. 0.02 -20 μg / ML DF 활용 및 PP 활용 (200 μl의 분석 볼륨의 최종 농도)에서 1시 10분 희석 계열을 만들어 마약 conjugates을 위해 예약된 유리병에 활용 솔루션의 적절한 금액을 추가합니다. 이러한 적정 실험은 각 환자에 대한 최적의 샘플 basophil 활성화의 농도를 결정하기 위해 수행되어야합니다.
- 각 튜브 50 μl 환자의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 전체 혈액 100 μl 자극 버퍼를 추가합니다. 신중하게 샘플을 섞는다.
- 피펫 20 μl Flow2 캐스트 얼룩의 phycoerythrin (PE)와 각 튜브에 플루오레신 isothiocyanate (FITC)로 표시 방지 CD63 항체로 분류 안티 CCR3 항체를 포함하는 시약 다시 섞는다. 흠없는 샘플에 얼룩 시약을 피펫하지 마!
- 37 ° C의 물을 욕조에 45 분 동안 샘플을 품어.
- 5 분 얼음에 반응을 중지합니다.
- 부드럽게 각 유리병과 와동 2.0 ML Flow2 주조 lysing 시약을 추가하여 적혈구를 Lyse. 상온에서 10 분 동안 어둠 속에 샘플을 품어.
- 5 500 XG 분만에 신중하게 가만히 따르다 뜨는에 대한 샘플을 원심 분리기.
- 유동세포계측법까지 얼음에 500 μl Flow2 CAST 세척 버퍼와 저장소에 세포를 Resuspend.
- 흐름 cytometer의 전압 s을 (를) 조정앞으로 측면 산란 (FSC, SSC)에 ettings 흠없는 샘플을 인수하면서.
- 게이트 세포는 SSC - PE의 음모에 SSC - FSC의 플롯에서 lymphocytes로 예측했다. Basophils는 CCR3 안녕 SSC ro와 게이트들을 FITC - PE의 음모로로 PE - 라벨 안티 CCR3 항체에 의해 식별됩니다. 활성 basophils을 감지 안티 CD63 항체는 FITC와 함께 표시됩니다.
- 부정적인 컨트롤에 CD63 하이로 basophils의 최대 절단 2.5 %를 설정합니다. > 5 % basophils는 CD63 안녕과 대조군의 MFI 나눈 샘플의 평균 형광 지수 (MFI) 2을 초과하는 (그림 3)하는 경우 샘플 basophil 활성화를위한 긍정적인 간주됩니다.
4. 대표 결과 :
이 실험은 IGE - 의존 약물 과민성을 감지하는 유익한 도구로 방망이를 평가합니다. NSAIDs의 단백질 conjugates은 basophils의 활성화를 위해 사용됩니다. HPSEC함으로써 RI 및 UV 감지 집합 상태, 결합도, 그리고 conjugates의 효과적인 수율로 결정됩니다. 그림 4 보여주는 바와 같이, DF의 conjugates의 43.5 %가 5.0 DF / HSA의 결합 학위 monomeric 있었다. 집계를위한 9.5의 결합 정도가 결정되었습니다. propyphenazone 활용은 21.2의 결합 학위 68.5 %의 단량체로 구성되어에 표시되었다. 집계의 결합 정도는 27.9했다. 총, DF의 conjugates의 결정 커플링 학위 7.6 DF와 PP의 conjugates의가 23.2이었습니다.
BAT는 NSAID 과민성에 IGE 종속 반응 조사를 허용 최적의 조건 (conjugates의 농도, 자극 시간)에 따라 conjugates와 함께 수행했습니다. basophils의 20.6 %가 활성화되었다 형광 강도 로그 이동 특징 : 그림 5에서와 같이 단지 PP 활용은 basophil 활성화 CD63 표면 표현의 upregulation에 의해 시각 트리거 수있었습니다. MFI는 1893-386 (대조군)에서 4.9의 요소에 의해 증가했습니다. 대조적으로, DF 공액 사용 basophils만이 3.1 %가 5% 차단 아래어진 활성화되었습니다. 또한 MFI는 210-197 (대조군)에서 요소 1.1 (한도 2.0)에 의해서만 증가했습니다. 검정 유효 기간에 의해 주어집니다은 (i) <부정적인 컨트롤의 5 % basophil 활성화, basophil subpopulation의 형광 강도 (2) 로그인 변화, 그리고 (iii)> 50 % 활성 basophils (긍정적인 제어).
그림 1. HSA에 DF와 PP 파생의 커플링. 해소 후 약품, 물, MES 버퍼 및 EDC (커플링 시약)가 추가됩니다. HSA는 마약 솔루션 pipetted되기 전에 샘플은 1 분 vortexed 있습니다. 상온에서 흔들어 2 시간 이내에 약물 covalently HSA에 바인딩. 단량체뿐만 아니라 집계가 발생할 수 있습니다.
그림 2. 커플링 도의 계산. 첫째, RI 및 K의 UV K 상수가 결정됩니다. 따라서, 알려진 농도와 HSA 표준 HPSEC 시스템에 주입합니다. (DN / DC) 및 HSA의 (DA / DC)은 각각 5, 0.185과 0.518의 가치를 부여하고 있습니다. 정상 지역은 상수를 계산하는 데 사용됩니다. 둘째, 각 약물 세 기준은 약물과 집중 특정 RI 및 UV 영역을 결정하기 위해 주입하고 있습니다. K의 RI 및 K의 UV 상수가 위의 단계에서 알려져 있으므로, 약물 관련 (DN / DC) 및 (DA / DC) 파생 상품을 계산하실 수 있습니다. 셋째, 약물의 HSA conjugates는 HPSEC로 주입됩니다. 그 결과 피크 영역은 두 개의 알 수없는 변수로 두 개의 방정식을 해결하여 최대마다 약물 및 HSA의 농도를 계산하는 데 사용됩니다.
그림 3. Basophil의 게이팅. lymphocytes 앞으로 뿌리 대 게이트 사이드 분산형 (SSC - FSC 줄거리)입니다 같은 세포는 예측했다. basophils는 문이 lymphocytes (SSC - CCR3 - PE의 줄거리)에서 CCR3 안녕 SSC 이오으로 식별됩니다. Basophils는 CD63 - FITC - CCR3 - PE의 음모에 활성화 (CD63 하이)에 대한 분석입니다. 대조군은 CD63 안녕을 남아있는 최대 2.5 %의 basophils의 차단을 설정하는 데 사용됩니다.
그림 4. 약물 conjugates의 결정 커플링도. RI 및 UV 신호는 약물의 HSA conjugates의 집계 (낮은 유지 볼륨에서 eluting)와 단량체를 (높은 유지 음량 eluting) 대표이 봉우리를 보여줍니다. 단량체 및 집합체의 비율 (RI 신호에서 결정)과 커플링 학위는 (N = 1)을 묘사하고 있습니다.
그림 5. Basophil activati시험. 약물 활용 - 활성화된 샘플, 부정적인 통제, 그리고 긍정적인 컨트롤의 결과는 CD63 - FITC - CCR3 - PE의 플롯 (N = 1)에 표시됩니다.
Discussion
BAT는 잘 설립된 아직 정기적으로 IGE - 중재 알레르기 질환 6,7의 진단 방법을 사용하지만. 낮은 분자량 화합물이 crosslink IGE 수용체, basophil 활성화 8 필수 수 없습니다와 같은 약물에 대한 과민성, 그러나, 그 적용 손실이 크다. 따라서, 조사중인 의약품 covalently 적합한 캐리어 단백질 (예 : HSA)에 결합해야합니다. 중요한 것은, 커플링 학위 (캐리어 단백질마다 약물 분자 즉, 숫자) conjugates의 (예 : IGE 수용체 상호 연결) 면역 활동을 보장하기 위해 제어해야합니다. 이론적으로, 캐리어 분자 당 두 haptens는 IGE 수용체에 대한 충분해야 교차 연결 및 HSA 당 다섯 DF 분자처럼 몇 가지는 세포 기반 분석 4 중재자 릴리스를 실행하는 표시되었습니다. 두 conjugates, PP - HSA 및 DF - HSA는 충분히 높은 커플링 학위 (HPSEC)을 표시하고 BAT에서 사용하기에 적합 시약 만들기 immunologically 적극적인 것으로 결정되었습니다. 또 다른 문제는 대신 부모 약물의 대사로 과민성 반응을 일으킬 수, 마약 metabolites는 역할을 수 있습니다. DF의 경우,이 가능성은 이전에 5 개의 주요 단계 전 metabolites 하나의 결합의 변형 4를 사용하여 상세하게 평가되었습니다. 마스터 설명한 기법을위한 중요한 요소는 혈액 샘플 (<혈액 수집, 검색 basophils의 수를 이후 12시간> 500)와 자극 조건 최적화 (시간, 투약)의 품질을 포함합니다. 또한,도 긍정적인 컨트롤 (항체는 IGE 수용체에 대한 감독) 식별해야 할과 반응하지 않은 조치를 소위. 따라서, 검증 기준은 긍정적인 제어로 안티 FcεRI 항체를 포함해야합니다. 약물 conjugates를 사용하는 중요한 이점은 그들은 마치 BAT 4 반 FcεRI 항체와 공동 자극에 의해 DF - HSA 활용에 표시되는 순수한 약물과는 달리 무독성 표시는 사실이다. 순수 DF는 반면, BAT 9 interpretability 문제를 일으키는 1.25 MG / ML의 농도에서 세포 독성 효과를 표시합니다. 일반적으로, 잠재적인 세포 독성에 대한 테스트를 강력하게 모든 새로 생산된 마약을 활용하는 것이 좋습니다.
여기, 우리는 IGE - 중재 과민성을 나타내기 위해 BAT에 사용되는 PP - HSA 활용의 잠재력을 보여주었다. 대조적으로, DF 과민성는 DF - HSA 활용에 대한 응답으로 basophil 활성화의 부족에 의해 입증 IGE와 관련되지 않습니다. 중요한 것은 IGE - 중재 메커니즘에 관한 불확실성의 경우, conjugates는 DF 4 보여왔다로 체외 세포 기반 분석 시스템에 의해 면역 활동을 평가해야합니다.
적당한 단백질 회사에 covalently 낮은 분자량의 약물을 결합의 설명 설정을 사용하면 항생제를 포함한 약물, 다른 NSAIDs, radiocontrast 미디어, 근육 relaxants, anesthetics에 대한 과민성 반응의 숫자를 분자 등 IGE - 중재의 참여에 대한 조사 수 있습니다 메커니즘. 따라서, BAT는 진단 (피부 반응 검사, 구강 도발 테스트)에 대한 기존 방법에 추가 될 수있다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 오스트리아 과학 기금 (FWF) 부여 P18820 - B13에 의해 투자되었다.
윤리 성명 :
연구는 1983 년에 개정하여 참여 모든 환자들이 서면 동의 준 정보로 헬싱키 Declaraction 준수 잘츠부르크 대학에서 인간 및 / 또는 동물에 관련된 실험 윤리위원회 (PLUS_Ethik_090514) 승인되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3671 | - |
| 7.8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL column | Tosoh Corp. | 08540 | - |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | 338962 | - |
| Bench top centrifuge | Sigma-Aldrich | - | - |
| Diclofenac sodium salt | Sigma-Aldrich | D6899 | - |
| EDTA-Vacutainer | BD Biosciences | 368589 | - |
| Flow2 CAST Kit | Bühlmann Laboratories | FK-CCR | Effective June 14, 2011 Flow2 CAST kit is now Flow CAST |
| HP1100 HPLC system | Hewlett-Packard | - | - |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | - |
| Laboratory centrifuge | Eppendorf | - | - |
| N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | E6383 | - |
| PBS tablets | AppliChem | A9199 | - |
| Propyphenazone derivative | University of Salzburg | - | - |
| Shaker | Eppendorf | - | - |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S1679 | - |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | 90421C | - |
| Sodium hydroxid | Sigma-Aldrich | S5881 | - |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | - |
| Triple detector array | Viscotek | TDA302 | - |
| Personal BioVortex V-1 plus | Peqlab | 90-V-1 | - |
| Water bath 1012 | GFL | 1012 | - |
References
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