Visualização da função respiratória mitocondrial usando Citocromo C Desidrogenase Oxidase / Succinato (COX / SDH) Histoquímica rotulagem dupla

Summary

O citocromo c oxidase desidrogenase / sódio (COX / SDH) método duplo-rotulagem permite a visualização direta de deficiências enzimáticas mitocondriais respiratória em seções de tecido fresco congelado. Esta é uma técnica simples histoquímica e é útil na investigação de doenças mitocondriais, envelhecimento, envelhecimento e distúrbios relacionados.

Abstract

DNA mitocondrial (mtDNA) defeitos são uma importante causa de doença e pode ser a base de envelhecimento e relacionadas ao envelhecimento ^1,2 alterações. A teoria mitocondrial do envelhecimento sugere um papel para mutações do mtDNA, que pode alterar a homeostase bioenergética e função celular, no processo de envelhecimento ^3. A riqueza de evidências foram compiladas em apoio a este ^1,4 teoria, a exemplo do mtDNA modificador do mouse ^5, mas o papel preciso de mtDNA danos do envelhecimento não é totalmente compreendido ^6,7.

Observando a atividade das enzimas respiratórias é uma abordagem simples para investigar a disfunção mitocondrial. Complexo IV ou citocromo c oxidase (COX), é essencial para a função mitocondrial. As subunidades catalítica da COX são codificadas por mtDNA e são essenciais para a montagem do complexo (Figura 1). Assim, a síntese adequada e função são em grande parte com base na integridade mtDNA ^2.Apesar de outros complexos respiratórios poderiam ser investigados, Complexos IV e II são as mais passíveis de exame histoquímico ^8,9. Complexo II ou succinato desidrogenase (SDH), é inteiramente codificada pelo DNA nuclear (Figura 1), e sua atividade normalmente não é afetado por deficiência mtDNA, apesar de um aumento pode indicar biogênese mitocondrial ^10-12. O mtDNA prejudicada observado em doenças mitocondriais, envelhecimento e doenças relacionadas à idade, muitas vezes leva à presença de células com baixa ou ausente a atividade da COX ^2,12-14. Embora as atividades de COX e SDH podem ser investigados individualmente, o método duplo-rotulagem seqüencial ^15,16 provou ser vantajoso para localizar células com disfunção mitocondrial ^12,17-21.

Muitas das constituições ótima do ensaio foram determinadas, como a concentração do substrato, receptores de elétrons / doadores, intermediário portadores de elétrons, a influência do pH e de reação time ^9,22,23. 3,3 '-diaminobenzidina (DAB) é um doador de elétrons eficaz e confiável ^22. Em células com funcionamento COX, o indamine marrom produto polímero irá localizar em cristas mitocondriais e saturar as células ^22. Essas células com COX disfuncionais, portanto, não ser saturado pelo produto DAB, permitindo a visualização da atividade SDH pela redução da nitroblue tetrazólio (NBT), um receptor de elétrons, a um produto azul final formazan ^9,24. Citocromo c e substratos succinato de sódio são adicionados para normalizar os níveis endógenos entre controle e doentes / mutante tecidos ^9. Catalase é adicionado como uma precaução para evitar possíveis reações contaminação da atividade da peroxidase ^9,22. Metasulfato fenazina (PMS), uma transportadora de elétrons intermediário, é utilizado em conjunto com azida de sódio, um inibidor da cadeia respiratória, para aumentar a formação dos produtos da reacção final de ^9,25. Apesar desta informarção, alguns detalhes críticos que afetam o resultado deste ensaio seemly simples, além de controles especificidade e avanços na técnica, ainda não foram apresentados.

Protocol

1. Preparação de tecidos para cryosectioning

1. Sacrificar o animal por qualquer deslocamento cervical ou a decapitação, em conformidade com a ética permitir disponíveis.
2. Recolher rapidamente os tecidos de interesse (por exemplo. Cérebro), e rapidamente congelar em gelo seco (tecidos podem exigir congelamento em isopentano ou propano refrigerado com nitrogênio líquido para obter a morfologia ideal). Loja de tecidos em folha de alumínio a -80 ° C até que esteja pronto para a seção.
3. Incorporar tecidos congelados em preparação para cryosectioning.
4. Coletar seções 14 mícrons criostato a -21 ° C (pode ser necessário para ajust....

Discussion

O método de COX / SDH combinado histoquímica permite a visualização de células com disfunção mitocondrial. Esta técnica, com estudos iniciais datam de 1968, permanece popular, com muitos considerando-o "padrão ouro" para a identificação de doenças mitocondriais em pacientes ^14,19,26,27. Agora, é freqüentemente usada para investigar o envelhecimento mutação mtDNA-driven e envelhecimento distúrbios relacionados ^{12,13,18,20,21,24.} A COX / SDH método duplo-rotulagem é frequentemente utilizado.......

Materials

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comments (opcional)
Gelo seco	AGA Gas AB	forma de bloco
Isopentano (2 metilbutano)	Sigma-Aldrich	277258 CAS: 78-78-4
Cyrostat solução incorporação	Sakura Finetek	Tissue Tek 4583
Criostato	Microm	Microm Modelo HM 500M
Slides	Thermo Scientific	Super geada Mais Menzel Glaser J1800AMWZ
Lamínulas de vidro Vidro borosilicato	VWR International	16004-098	24 x 50 mm
Papel de filtro	Munktell Filtro AB	Qualidade: 1350 ArtigoNúmero: 242 001	430 x 430 mm
Tetrahidrocloreto 3,3 'diaminobenzidina (DAB)	Sigma-Aldrich	Sigma Sistema de substrato líquido, D7304
Citocromo c (Tipo III, do coração de eqüinos)	Sigma-Aldrich	C2506 CAS: 9007-43-6
Bovina catalase (de fígado)	Sigma-Aldrich	C9322 CAS: 9001-05-2
Nitroblue tetrazólio (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876 CAS: 298-83-9
Succinato de sódio	Sigma-Aldrich	S2378 CAS: 6106-21-4
Metasulfato fenazina (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625 CAS: 299-11-6	PMS é sensível à luz. Escudo da luz.
Azida de sódio	Sigma-Aldrich	S8032 CAS: 26628-22-8
Xileno	VWR International	EM-XX0060-4
Entellan	VWR International	100503-870
Malonato (Ácido malónico)	Sigma-Aldrich	M1296 CAS: 141-82-2