Artigo de método

Um método para Etiquetagem Vascularização no embrião do rato

DOI:

10.3791/3267

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7 de outubro de 2011

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1Department of Cellular Biology, University of Georgia, 2Centre for Immunology and Infection, Department of Biology and HYMS, University of York, 3Department of Genetics, University of Georgia

Neste artigo

Resumo

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Este artigo descreve um método para a rotulagem de pele embrionária e vasos sanguíneos do timo.

Resumo

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O estabelecimento de uma rede funcional dos vasos sanguíneos é uma parte essencial da organogênese, e é necessário para a função do órgão ideal. Por exemplo, na formação adequada vascularização do timo e padronização é essencial para a entrada timócito no órgão e saída de células T maduras para a periferia. O arranjo espacial dos vasos sanguíneos no timo é dependente de sinais a partir do microambiente local, ou seja, células epiteliais tímicas (TEC). Vários relatórios recentes sugerem que a interrupção desses resultados no timo sinais de sangue 1,2 defeitos navio. Estudos anteriores descreveram técnicas usadas para rotular os 1,2 vasculatura neonatal e adulto timo. Nós demonstramos aqui uma técnica para a rotulagem dos vasos sanguíneos no timo embrionárias. Este método combina o uso de FITC-dextran ou Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectina I (GSL 1 - isolectin B 4) injeções veia facial e coloração de anticorpos CD31 para identificar timo estruturas vasculares e PDGFR-β para rotular tímica perivascular mesênquima 3-5. A opção de usar ou seções criosecções vibratome também é fornecido. Este protocolo pode ser usado para identificar defeitos do timo vascular, que é crítico para a definição dos papéis dos TEC derivadas moléculas na formação do timo dos vasos sanguíneos. Como o método de rótulos toda a vasculatura, ele também pode ser usado para analisar as redes vascular em vários órgãos e tecidos em todo o embrião, incluindo pele e do coração 60-10.

Protocolo

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1. Fluoresceína rotulados dextran e GSL I-isolectin B 4 injeções veia facial para rotular vasculatura embrionárias

  1. Prepare FITC-dextran (50ug/mL) em tampão fosfato salino (PBS) ou GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) em PBS em um tubo Eppendorf 1,5 ml e aquecer a 37 ° C. Adicionar 100uL de estoque 1,25 mM Fast Green / PBS para a solução FITC-dextran (volume total de 1ml) e 180uL de estoque 1,25 mM Fast Green / PBS a um GSL - isolectin B 4 (200uL volume total), de modo que a solução é visivelmente azul.
  2. E14.5-E18.5 dissecar embriões e saco vitelino juntos, deixando o talo alantóide (artéria e veia umbilical) intacta.....

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Discussão

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Todo o monte e PECAM-1 (CD31) coloração em cortes são os métodos convencionais para a rotulagem da vasculatura embrionárias em camundongos. Estes métodos requerem o uso de imunofluorescência direta e / ou indireta, e detergentes para permeabilizar o tecido mouse. Isso prova a ser um processo bastante oportuna. Aqui, nós empregamos FITC-dextran ou isolectin B 4 injeções veia facial diretamente rótulo a vasculatura embrionárias, eliminando a exigência de rotulagem passos de anticorpos. Além disso, este método p.......

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado por números conceder R01AI055001 e R01AI082127 de NIAID a NRM e Award Fellowship SREB Dissertação de JLB.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de catálogo
FITC-dextran Sigma FD150S-1G
Fluoresceína rotulados GSL 1 - B isolectin 4 Vector Laboratories FL-1201
Verde rápido Biomedicals MP 195178
PFA Fluka 76240
Soro fetal bovino Atlanta Biologicals S11550
Composto Temperatura ideal de corte (OCT VWR 25608-930
Acetona JT Baker 9006-33
Donkey Serum Jackson 017-000-121
rato anti-CD31 do mouse, BD PharMingen 558736
cabra anti-rato PDGFR β- R & D Systems AF1042
donkey anti-CD31 rato Alexa 647 (Invitrogen) Biolegend 102516
burro anti-cabra Alexa 594 (Invitrogen) Invitrogen A11058
Triton X -100 Sigma-Aldrich X-100
Baixo derreter agarose / PBS Sigma-Aldrich A9414-25G
Metanol Fisher Scientific A413-4
Álcool benzílico Acros Scientific 148390010
Benzoato de benzila Acros Scientific 105860010
Slides depressão Fisher Scientific S175201
Fluorogel Microscopia Eletrônica de Ciências 17985-10
Cobertura de vidro (22x22) -1,5 Thermo Scientific 152222
Zeiss LSM 510 Meta Microscópio Confocal Zeiss
Micro pinça de dissecação Roboz RS-5135
Parafilm No. OM992 Fisher Scientific 13-374-16
12 e 24 microplacas bem Scientific Evergreen 222-8044-01F
Superfrost / Plus Lâminas de Microscopia Fisher Scientific 12-550-15
4mL frascos claros Científica Nacional B7800-2

Referências

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  1. Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
  2. Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ....

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Vasculatura Embrion ria de CamundongoInje o na Veia FacialMarca o com FITC DextranaGSL 1 Isolectina B4Colora o com Anticorpo CD31PDGFR Beta PerivascularProtocolo de CrioseccionamentoSeccionamento por Vibr tomoImagem por Microscopia ConfocalAn lise Vascular do Timo

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