Cultura e Eletrofisiologia de células em NRCC patch-clamp-Chips

Resumo

Nós mostramos como planar de patch-clamp fichas fabricado no National Research Council of Canada são esterilizados, preparado, carregado com médio, revestida com as células, e usado para gravações eletrofisiológicas.

Resumo

Devido à sua extraordinária sensibilidade ea capacidade de monitorar e controlar células individuais a nível dos canais iônicos, patch de aperto é o padrão ouro de eletrofisiologia aplicada a modelos de doenças e telas farmacêuticas tanto ^1. O método envolve, tradicionalmente, suavemente contactando uma célula com uma pipeta de vidro cheio de uma solução fisiológica a fim de isolar um pedaço de membrana sob o seu ápice ^2. Um eléctrodo inserido na pipeta captura do canal de íon actividade dentro do remendo de membrana ou, quando há ruptura, por toda a célula. Na última década, de patch-clamp fichas têm sido propostos como uma alternativa ^{3, 4:} uma película suspensa separa o meio fisiológico a partir do meio de cultura, e uma abertura microfabricados no filme substitui o vértice da pipeta. Patch-clamp fichas foram integrados em sistemas automatizados e comercializado para high-throughput screening ^5. Para incrfacilidade de transferência, que incluem a entrega fluídica de células de suspensão, o seu posicionamento sobre a abertura por sucção, e rotinas de automatizados para detectar células de sonda-selos e entra em modo de célula inteira. Nós relatamos na fabricação de um chip de silício de patch-clamp com impedância otimizada e forma do orifício que permite a gravação de alta qualidade de potenciais de ação em neurônios cultivados caracol ^6; recentemente, temos também relataram progressos no sentido de interrogar os neurônios de mamíferos ^7. Os nossos de patch-clamp fichas são fabricados no Canadian Photonics Fabrication Centro ^8, uma fundição comercial, e estão disponíveis em grandes séries. Estamos ansiosos para participar de colaborações com eletrofisiologistas para validar o uso da tecnologia NRCC em diferentes modelos. As fichas são utilizados de acordo com o esquema geral representado na Figura 1: o chip de silício está na parte inferior de um frasco de cultura Plexiglas e parte de trás da abertura é ligado a um Chann subterrâneael equipado com tubos em cada extremidade da embalagem. As células são cultivadas no frasco ea célula na parte superior da sonda é monitorizada por um eléctrodo de medição inserido no duas channel.The fora dos portos fluídicos facilitar a troca de solução com perturbação mínima para a célula, o que é uma vantagem em comparação com pipetas de vidro para intracelular perfusão.

Figura 1. Princípio de medição usando o chip de patch-clamp NRCC

Nós detalhe aqui os protocolos para esterilizar e escorvar os chips, carregá-los com placa de suporte, os com células e, finalmente, utilizá-los para gravações electrofisiológicos.

Protocolo

1. Fabricação de chips

O processo descrito em ⁶ resultados de uma 3 micrómetros película auto-pé de espessura, uma baixa resistência de 1 acesso Mohm e uma superfície lisa de abertura em forma de funil, que facilita uma vedação íntimo com a célula ^9, ver Figura 2. As aparas são singulated e coladas em pacotes de Plexiglas com a abertura virada um furo de ligação do chip para um canal subterrâneo. A colagem é dispensado de uma maneira que minimiza a capacitância de derivação para um pF 17 nominal. Os pacotes são equipados com duas mm de diâmetro e 1,5 mm 6 tubos de vidro longas como portas fluídicos (Figura 3).

Figura 2. Micrografia eletrônica de varredura de uma secção de feixe de íons focalizados de um chip de patch-clamp NRCC mostra uma superfície lisa dióxido de silício e forma de funil, que favorece os contatos íntimos de células, e um orifício superficial que representa uma resistanc baixo acessoe.

Figura 3. Um chip é colada no fundo do frasco de cultura em um pacote de Plexiglas equipado com fluidos subterrâneos e tubos de vidro.

2. Priming, esterilização e testes

Os seguintes passos devem ser realizados em um gabinete de segurança de biologia para evitar a contaminação ou obstrução da abertura.

• Esterilizar fichas em um líquido de limpeza Harrick plasma de base (www.harrickplasma.com) com uma pressão de ar 0,1-0,3 mbar residual durante 15 min à potência máxima de 18 W. Outros sistemas de ar de plasma pode ser utilizado, com a densidade de potência comparável (24 mW / cm ³⁾ e mantendo o produto da densidade de potência e constante de tempo. O tratamento com plasma também torna os chips hidrofílico, o que facilita a escorva.
• Coloque os tubos de vidro com tubos de silicone Silastic Laboratório estéril, 1mm x 2mm ID OD (Cole ParmerCat. # 96115-08), 3inch de um lado, uma polegada do outro lado.
• Encha fluídica através dos tubos com esterilizada por filtração da solução tampão de padrão de fosfato (PBS), certificando-se nenhuma bolha é aprisionado.
• Clip do tubo de silicone longo tempo de pressurizar o PBS a partir do lado curto, a 1 atm. Um conjunto de PBS que escoa através da abertura pode ser visível no frasco. Prenda o fornecimento pressurizado do PBS e retire o tubo de silicone curta distância que a oferta.
• Encha frasco com filtrada PBS utilizando uma seringa.
• Imergir um Ag / Ag: Cl eléctrodo no tubo curto e um contra-eléctrodo no frasco. Um medidor de impedância é utilizada para confirmar que a resistência de acesso é entre 300kohm e 3Mohm ea capacitância shunt é entre 10pF e 25pF. Um chip com menor resistência é provável que tenha um vazamento, e uma maior capacitância é considerado impróprio para uso, pois não pode capturar mais rápido dinâmica de eletrofisiologia da célula ^6. Um chip com menor capacidadeou maior resistência é considerado conectado, embora pudesse ser simplesmente que uma bolha está preso no orifício. Alguns chips são testados novamente depois de 1H e encontrado para ter a impedância eletroquímica correta.
• Lavar o canal fluídica com água desionizada estéril; esvaziar o frasco de topo e lavar com o mesmo, duas vezes.
• Mergulha-se o chip de embalado, com tubos em água estéril fresco desionizada durante 30 min, em seguida, carregar com outros chips em um recipiente estéril cheio com água desionizada estéril. Isto assegura que os chips permanecem hidrófilo e protegido de contaminação.

3. Fichas de preparação em laboratório de biologia celular

As seguintes etapas são realizadas em uma capela de fluxo laminar filtrado HEPA usando técnicas assépticas, todas as soluções utilizadas neste procedimento deve ser filtrada esterilizados antes da utilização usando um filtro de 0.22μm.

• Abra um recipiente de chips sob uma capela de fluxo laminar filtrado HEPA e retirar as fichas de ContaINER face para baixo para evitar escavar possíveis contaminantes flutuantes em frasco superior.
• Lavar parte superior do frasco de 2x chip com filtrada água estéril desionizada para remover todos os detritos residual a partir da superfície do chip.
• Aspirar água desionizada estéril fora do frasco de topo.
• Ligue uma extremidade do tubo de silastic ligado ao canal de fluídica a uma seringa pressurizada contendo água filtrada estéril desionizada. No nosso sistema, seringas preenchidas com solução são pressurizados por ligação a um reservatório de ar comprimido definido para 20psi. Para garantir a esterilidade, o ar é filtrado (filtro de 0,22 um) antes da entrada para a seringa e nosso sistema também tem uma válvula de ligar / desligar que nos permite parar ou aplicar pressão quando necessário.
• Usando um hemostato, fixar a extremidade de saída da tubagem.
• Abra o de ligar / desligar as válvulas para pressurizar a solução.
• Para enxaguar o fluídica subterranen do chip com água estéril fresco desionizada, unclamp a extremidade de saída da tubagem.
• Para parace a água para cima através da abertura, fixar a extremidade de saída da tubagem com um hemostato.
• Para evitar a drenagem da água, prenda as extremidades de entrada e saída da tubulação com uma hemostats e fechar a on / off válvulas.
• Separar a extremidade de entrada da tubagem a partir da seringa.
• Inserir tampões de vidro em ambas as extremidades do tubo e remover os hemostats.
• Preencha frasco topo com água deionizada steriled filtro.
• Colocar a tampa de um prato 35 milímetros esterilizada na base de um prato 100 milímetros estéril
• Chip de lugar na parte superior da tampa 35 mm, e com tampa 100 tampa prato mm.
• Fichas de imagem para garantir que a membrana ea abertura das fichas são livres de detritos e / ou bolhas de ar. No nosso laboratório usamos um microscópio vertical e uma 20x objectivo de longa distância de trabalho.
• Se detritos e / ou bolhas de ar, lavar repetidamente canal fluídico e frasco superior. Se os detritos e / ou bolhas de ar não pode ser removido, o chip é descartado.
• Uma vez que os chips sãodigitalizado, retornar à câmara de fluxo laminar e desligue ambas as extremidades do tubo.
• Anexar uma extremidade do tubo a uma seringa pressurizada contendo meios fisiológicos.
• Prender a extremidade de saída da tubagem com um hemostato
• Abrir a válvula de pressão, remover o hemostato a partir da extremidade de saída dos fluidos e lave o canal fluídica com meios fisiológicos
• Para enxaguar o fluídica subterrâneo com meios fisiológicos, abrir a de ligar / desligar as válvulas e remover o hemostato a partir da extremidade de saída da tubagem.
• Para forçar os meios fisiológicos para cima através da abertura, fixar a extremidade de saída da tubagem com um hemostato.
• Prenda no lado de entrada da tubulação com uma pinça hemostática e fechar a on / off válvulas.
• Remover a extremidade de entrada do tubo da seringa e ficha ambas as extremidades do tubo por meio de tampões Glas.
• Remova os hemostats.
• Remover a água do frasco de topo.
• Encher o frasco de topo com filtros de esterilizados meios fisiológicos.
• Coloque novamente o chip no prato 100 milímetros Petri.
• Coloque a base de um prato 35 milímetros para o prato 100 mm e enchê-lo com água esterilizada por filtro desionizada para enriquecer humidade.
• Cubra o prato até o momento para revestimento

4. Revestimento celular dos neurônios caracol

Os chips de patch-clamp pode ser adequado para uma variedade de preparações. Estamos atualmente testando as nossas fichas com mamíferos primárias de neurônios corticais e que tenham obtido resultados preliminares com células cultivadas por 14 dias ^7, o que indica que nosso protocolo de esterilização é adequada e que os chips não são citotóxicos em culturas a longo prazo. Para efeitos do presente protocolo, os neurônios de moluscos foram escolhidos porque representam um modelo simples, mas bem estabelecido para estudar a eletrofisiologia neuronal ^11, e é com essas células que obtivemos os resultados mais significativos para a data de ^10. Isolamento das células e procedimentos detalhados cultura têmforam descritas anteriormente ^{12, 13.}

• Remova a casca exterior 2-3 stagnalis meses Lymnaea velho com uma pinça sem corte e animais anestesiam em Lymnaea salina contendo Listerine 10%.

  Todos os passos subsequentes realizada assepticamente dentro de uma capa fluxo de ar laminar com equipamento de dissecção estéril e soluções à temperatura ambiente.

• Substituir mídia fisiológicas nas fluídica com a solução de gravação apropriado usando uma pipeta Eppendorf. No caso de neurónios Lymnaea a solução contém (em mM): 50 KCl, 5 _MgCl2, 5 etilenobis (oxietilenonitrilo) de ácido tetraacético (EGTA) e 5 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfónico (HEPES, pH 7,4 ; 130 mOsm) ¹⁴
• Pino os caracóis em um prato Sylgard preenchido com solução salina e Lymnaea remover cérebro inteiro, como descrito anteriormente ¹³
• Trate o isolacérebros ed em meio definido (MS) de enzima tripsina (solução a 0,2%, Sigma, catálogo # T-9201) durante 18 minutos, seguido por tratamento em DM e inibidor de tripsina (Sigma, soja, Catalog # T-9003) durante 15 minutos.
• Fixar os cérebros em um prato Sylgard pequeno enchido com alta osmolaridade definido mídia (HODM - DM com glicose adicionado; 750 uL de solução de glicose 1M a 20 mL de MS).
• Usando fórceps finos e tesouras de dissecação, remover o invólucro exterior e interior dos gânglios de interesse, expondo os neurónios.
• Usando uma pipeta de vidro polido fogo preenchido com HODM e ligada a uma microsseringa, aplicar sucção suave perto da célula de interesse (dorsal pedal esquerdo 1) até que o neurónio destaca a partir do cérebro e é suspenso na pipeta.
• A pipeta de vidro é então movido e mergulhado neurochips individuais quando o afastamento suave a partir do micro-permite que os neurónios a ser suavemente empurrada para fora da pipeta e colocado no topo dos furos de patch individuais sobre as fichas.
• Permitir que as células se sentar sem ser perturbado por um mínimo de 2 horas à temperatura ambiente para promover a sua fixação à superfície do chip em torno da abertura.

5. Gravações eletrofisiológicas

Para ligar as fichas para o amplificador (no nosso caso de um amplificador Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, EUA)

• Substituir a solução no fluídica subterrânea e no frasco de chip com as soluções de gravação adequado. No caso de neurónios Lymnaea, as câmaras de cultura superiores são preenchidos com Lymnaea salina (em mM: NaCl 51,3, 1,7 KCl, 4 CaCl2, e 1,5 MgCl2) tamponado a pH 7,9 com HEPES ^14.
• Para a estabilidade, chip cola o numa lâmina de vidro e colocá-lo sob um microscópio.
• Para ligar o chip para o amplificador (no nosso caso de um amplificador Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, EUA), cortar uma das extremidades do tubo e inserir uma Silver fio que está ligado à cabeça fase.
• Coloque o eléctrodo de referência no frasco parte superior do chip.
• O chip está agora pronto para a gravação.
• Aplicar um passo mV 5 com o amplificador para medir a resistência total (R _t) e determinar a configuração dos neurónios: célula-inscritos (R _t> 1 GΩ); célula inteira (Rt = 50-100 transientes mohms mais capacitivo, indicativa de ruptura da membrana sobre a abertura); ou nenhuma vedação (R _t <5 mohms). No nosso último conjunto de experiências ^10, 58 por cento% das células teve alta resistência selos e, destes, 80% das células mostraram respostas excitáveis.

6. Os resultados representativos

• Aplicar despolarizante impulsos de corrente (20 incremento pA) para o neurónio (neste caso LPeD1).
• Segure o neurônio em Vm próximo do seu potencial de repouso (~ - 60 mV).
• Observe as respostas a estes pulsos despolarizantes. Potenciais de ação ultrapassagem deveser observado se o neurônio é viável.
• A Figura 4 mostra um resultado representativo, que é discutida em detalhe em ^{14, 15.}

Figura 4. Respostas Tensão (superior) de um neurônio LPeD1 a série graduada de intracelulares pulsos de corrente (abaixo). Os impulsos de corrente foram aplicados em Vm = - 60mV.

Solução de problemas

• Antes do plaqueamento, os chips de imagem para determinar se membrana ea abertura são livres de detritos e adequado para o plaqueamento. Nós usamos um microscópio vertical e um 20x objetivo de longa distância de trabalho. Em nosso último conjunto de experimentos ^1, 67% por cento dos chips foram preparadas com sucesso dessa forma.
• Se detritos e / ou bolhas de ar estão presentes descartar chip e tentar outro.
• Diversos tratamentos de superfície (plasma) ou revestimento (PDL, PEI, etc) pode ser tentado, mas o sucesso pode ser altamente dependente tipo de célulausado.
• A composição da solução de fluídica ("pipeta") em crítica para a formação do giga-seal e toda a célula. Ajuste a solução, prestando atenção ao pH da osmolaridade, e maquiagem iônica.
• Para a cultura de longo prazo, começar com a mídia em canais microfluídicos, em seguida, mudar para pipetar solução antes da gravação através de suave perfusão gravidade alimentado (~ 0,5 ml / min).

Discussão

Patch-clamp NRCC da plataforma interrogatório chip é uma ferramenta potencialmente poderosa para os testes de conteúdo de informação de alta farmacêuticas e investigar modelos in vitro de doença. As suas vantagens em comparação com pipetas de vidro são uma resistência de acesso de baixo, que é uma vantagem para sondar células grandes, e apesar de uma capacitância um pouco maior irá resultar em dinâmica comparáveis ​​para as células mais pequenas. Célula espontânea para selos de abertura foram rotineiramente obtidos, e entrada de célula inteira foi observado para ser ¹⁴ espontânea. Uma clara diferença entre chips e pelo método da pipeta de vidro é o facto de que a sonda é parte do prato de cultura de células e não é manualmente posto em contacto com a membrana celular. Cultura de células, possivelmente parte de redes funcionais, resulta em modelos mais biologicamente relevantes, como modelos de doenças, e um mecanismo diferente para garantir alta de células para sondar selos ^16. No entanto, em contraste com as suspensões de células, a aspiração cannot ser usado para posicionar uma célula na sonda. Neurónios Snail, como outras células grandes, são passíveis de posicionamento manual na parte superior da sonda. Para as células mais pequenas que requerem tempos mais longos de cultura, temos obviado a necessidade de qualquer manipulação e manter uma alta probabilidade de obtenção de uma vedação por polipéptidos de adesão de modelação em cima das sondas para colocar as células em cima das sondas, e demonstraram a colocação de células na sonda ^17,18.

NRCC também está a desenvolver um chip de poliimida de patch-clamp microfluídico ¹⁹ com uma capacitância comparável ao do vidro pipeta. O objetivo final desse projeto é um múltiplo de sondas chip de patch-clamp que permite o monitoramento simultâneo da atividade eletrofisiológica dos neurônios envolvidos em várias comportamento da rede para a resolução dos canais iônicos individuais ^14. Este método é um método de resolução alta complementar para matrizes de multi-eléctrodo 20.