Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Nós mostramos como planar de patch-clamp fichas fabricado no National Research Council of Canada são esterilizados, preparado, carregado com médio, revestida com as células, e usado para gravações eletrofisiológicas.
Devido à sua extraordinária sensibilidade ea capacidade de monitorar e controlar células individuais a nível dos canais iônicos, patch de aperto é o padrão ouro de eletrofisiologia aplicada a modelos de doenças e telas farmacêuticas tanto 1. O método envolve, tradicionalmente, suavemente contactando uma célula com uma pipeta de vidro cheio de uma solução fisiológica a fim de isolar um pedaço de membrana sob o seu ápice 2. Um eléctrodo inserido na pipeta captura do canal de íon actividade dentro do remendo de membrana ou, quando há ruptura, por toda a célula. Na última década, de patch-clamp fichas têm sido propostos como uma alternativa 3, 4: uma película suspensa separa o meio fisiológico a partir do meio de cultura, e uma abertura microfabricados no filme substitui o vértice da pipeta. Patch-clamp fichas foram integrados em sistemas automatizados e comercializado para high-throughput screening 5. Para incrfacilidade de transferência, que incluem a entrega fluídica de células de suspensão, o seu posicionamento sobre a abertura por sucção, e rotinas de automatizados para detectar células de sonda-selos e entra em modo de célula inteira. Nós relatamos na fabricação de um chip de silício de patch-clamp com impedância otimizada e forma do orifício que permite a gravação de alta qualidade de potenciais de ação em neurônios cultivados caracol 6; recentemente, temos também relataram progressos no sentido de interrogar os neurônios de mamíferos 7. Os nossos de patch-clamp fichas são fabricados no Canadian Photonics Fabrication Centro 8, uma fundição comercial, e estão disponíveis em grandes séries. Estamos ansiosos para participar de colaborações com eletrofisiologistas para validar o uso da tecnologia NRCC em diferentes modelos. As fichas são utilizados de acordo com o esquema geral representado na Figura 1: o chip de silício está na parte inferior de um frasco de cultura Plexiglas e parte de trás da abertura é ligado a um Chann subterrâneael equipado com tubos em cada extremidade da embalagem. As células são cultivadas no frasco ea célula na parte superior da sonda é monitorizada por um eléctrodo de medição inserido no duas channel.The fora dos portos fluídicos facilitar a troca de solução com perturbação mínima para a célula, o que é uma vantagem em comparação com pipetas de vidro para intracelular perfusão.
Figura 1. Princípio de medição usando o chip de patch-clamp NRCC
Nós detalhe aqui os protocolos para esterilizar e escorvar os chips, carregá-los com placa de suporte, os com células e, finalmente, utilizá-los para gravações electrofisiológicos.
1. Fabricação de chips
O processo descrito em 6 resultados de uma 3 micrómetros película auto-pé de espessura, uma baixa resistência de 1 acesso Mohm e uma superfície lisa de abertura em forma de funil, que facilita uma vedação íntimo com a célula 9, ver Figura 2. As aparas são singulated e coladas em pacotes de Plexiglas com a abertura virada um furo de ligação do chip para um canal subterrâneo. A colagem é dispensado de uma maneira que minimiza a capacitância de derivação para um pF 17 nominal. Os pacotes são equipados com duas mm de diâmetro e 1,5 mm 6 tubos de vidro longas como portas fluídicos (Figura 3).
Figura 2. Micrografia eletrônica de varredura de uma secção de feixe de íons focalizados de um chip de patch-clamp NRCC mostra uma superfície lisa dióxido de silício e forma de funil, que favorece os contatos íntimos de células, e um orifício superficial que representa uma resistanc baixo acessoe.
Figura 3. Um chip é colada no fundo do frasco de cultura em um pacote de Plexiglas equipado com fluidos subterrâneos e tubos de vidro.
2. Priming, esterilização e testes
Os seguintes passos devem ser realizados em um gabinete de segurança de biologia para evitar a contaminação ou obstrução da abertura.
3. Fichas de preparação em laboratório de biologia celular
As seguintes etapas são realizadas em uma capela de fluxo laminar filtrado HEPA usando técnicas assépticas, todas as soluções utilizadas neste procedimento deve ser filtrada esterilizados antes da utilização usando um filtro de 0.22μm.
4. Revestimento celular dos neurônios caracol
Os chips de patch-clamp pode ser adequado para uma variedade de preparações. Estamos atualmente testando as nossas fichas com mamíferos primárias de neurônios corticais e que tenham obtido resultados preliminares com células cultivadas por 14 dias 7, o que indica que nosso protocolo de esterilização é adequada e que os chips não são citotóxicos em culturas a longo prazo. Para efeitos do presente protocolo, os neurônios de moluscos foram escolhidos porque representam um modelo simples, mas bem estabelecido para estudar a eletrofisiologia neuronal 11, e é com essas células que obtivemos os resultados mais significativos para a data de 10. Isolamento das células e procedimentos detalhados cultura têmforam descritas anteriormente 12, 13.
Remova a casca exterior 2-3 stagnalis meses Lymnaea velho com uma pinça sem corte e animais anestesiam em Lymnaea salina contendo Listerine 10%.
Todos os passos subsequentes realizada assepticamente dentro de uma capa fluxo de ar laminar com equipamento de dissecção estéril e soluções à temperatura ambiente.
5. Gravações eletrofisiológicas
Para ligar as fichas para o amplificador (no nosso caso de um amplificador Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, EUA)
6. Os resultados representativos
Figura 4. Respostas Tensão (superior) de um neurônio LPeD1 a série graduada de intracelulares pulsos de corrente (abaixo). Os impulsos de corrente foram aplicados em Vm = - 60mV.
Solução de problemas
Não há conflitos de interesse declarados.
Nós mostramos como planar de patch-clamp fichas fabricado no National Research Council of Canada são esterilizados, preparado, carregado com médio, revestida com as células, e usado para gravações eletrofisiológicas.
Os autores gostariam de agradecer Alexei Bogdanov para a fabricação de patch-clamp fichas no CPFC, e Tran Hue, Ping Zhao e Mateus Shiu para obter ajuda com a montagem. Naweed Syed foi apoiada por um Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR) subvenção. Collin Lucas é o destinatário da NSERC e Patrimônio Alberta Fundação de Pesquisa Médica (AHFMR) bolseiros.
