Mudando a direção e orientação do campo elétrico Durante Elétrica Aplicação Pulsos melhora a transferência de Gene Plasmid In vitro</em

Resumo

Transfecção gênica por eletroporação é melhorada aproximadamente duas vezes quando a orientação do campo elétrico é alterado durante a aplicação do pulso, enquanto que a viabilidade das células não é afetado. O aumento da transfecção do gene é causada pelo aumento da área de membrana que é feito competentes para a entrada de DNA na célula.

Resumo

Gene electrotransfer é um método físico utilizado para entregar genes dentro das células através da aplicação de curto e intenso pulsos elétricos, que causam a desestabilização da membrana celular, tornando-a permeável a pequenas moléculas e permite a transferência de grandes moléculas como o DNA. Ela representa uma alternativa aos vetores virais, devido à sua eficácia, segurança e facilidade de aplicação. Para o gene electrotransfer diferentes protocolos de pulso elétrico são utilizadas a fim de alcançar transfecção gênica máximo, um deles está mudando a direção do campo elétrico e orientação durante a entrega de pulso. Mudando de direção e orientação do campo elétrico aumentar a área de membrana competentes para a entrada de DNA na célula. Neste vídeo, demonstramos a diferença na eficácia electrotransfer gene, quando todos os pulsos são entregues na mesma direção e quando os pulsos são entregues mudando alternadamente a direção do campo elétrico e de orientação. Para esta dica propósito com eletrodos integrados e de alta tensão do gerador protótipo, que permite a mudança do campo elétrico em diferentes direções durante a aplicação do pulso elétrico, foram usados. Gene electrotransfer eficácia é determinada 24h após a aplicação do pulso como o número de células expressando a proteína fluorescente verde dividido com o número de todas as células. Os resultados mostram que a transfecção de genes é aumentada quando a orientação do campo elétrico durante o parto pulso elétrico é alterado.

Protocolo

1. Cultura de células, plasmídeos e preparação de buffer para o experimento

1. Neste experimento células de ovário de hamster chinês (CHO-K1) são utilizados. As células são cultivadas em uma mistura de nutrientes HAM-F12 (PAA), suplementado com 2 mM L-glutamina, 10% de soro fetal bovino, 400 mL / l de gentamicina (todos da Chemie GmbH Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha), e 1 ml / l crystacilin (Pliva, Zagreb, Croácia). As células são mantidas a 37 ° C em 5% CO ₂ umidificado atmosfera na incubadora por 24h.
2. Amplificar plasmídeo pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, EUA), codificação de uma proteína fluorescente verde (GFP) em tensão DH5α de Escherichia coli e isolá-lo com o Kit Maxi HiSpeed ​​Plasmid (Qiagen, Hilden, Alemanha). Concentração de DNA plasmidial (plasmídeo dissolvido em tampão TE) deve ser determinada espectrofotometricamente a 260 nm e confirmada por eletroforese em gel.
3. Prepare tampão fosfato de sódio isoosmolar (10 mM Na ₂ HPO _4, 10 mM NaH ₂ PO _4, 1 mM MgCl _2, 250 mM de sacarose, pH 7,4).
4. No dia do experimento preparar suspensão celular por tripsinização com 0,25% de tripsina / EDTA (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Alemanha). Células centrifugar por 5 min a 1000 rpm (180 xg) a 4 ° C (Sigma, Alemanha) e ressuspender pellet celular em tampão fosfato de sódio isoosmolar a uma densidade de células de 5 × 10 ⁶ células / ml.

2. Equipamentos de hardware

1. Células são expostas ao campo elétrico na ponta da pipeta (Figura 1) com eletrodos integrados ligado a um gerador de protótipos de alta tensão. A ponta do eletrodo ea geometria permite a aplicação de relativamente homogênea campo elétrico e do gerador permite a entrega de pulsos elétricos em direções diferentes. A ponta eo gerador foram desenvolvidos no Laboratório de Biocybernetics, Faculdade de Engenharia Elétrica, Universidade de Ljubljana ^1.

Figura 1. Vertical e horizontal (a) seção transversal e fotografia (b) da ponta da pipeta com eletrodos integrados. Na cruz de cor cinza seção é usada para a caixa de plástico e preto para os eletrodos. A ponta da pipeta com eletrodos integrados é composta por quatro eletrodos haste cilíndrica. Os eletrodos são feitos de aço inoxidável; seu diâmetro é de 1,4 mm, eletrodos adjacentes são de 1 mm, com eletrodos opostos são 2 mm. Os eletrodos são colados na ponta de plástico em paralelo e seu comprimento aplicável é de 30 mm ^2.

3. Gene electrotransfer protocolo

1. Adicionar plasmídeo pEGFP-N1 a uma suspensão de células em concentração de 10 mg / ml.
2. Incubar a mistura por 2-3 minutos em temperatura ambiente, antes da aplicação de impulsos elétricos.
3. Aspire mL 100 de suspensão de células para a ponta da pipeta com eletrodos integrados.
4. Para alcançar eficácia melhor electrotransfer gene e manter a viabilidade celular, os parâmetros ideais de pulsos elétricos devem ser usados. Neste experimento um trem de pulsos retangulares de 8 (cada uma com duração de 1 ms, amplitude 225 V na freqüência de 1 repetição Hz) é aplicado a cada amostra, utilizando alta tensão do gerador protótipo. Dois diferentes protocolos de campo elétrico (Figura 2) são usados: no primeiro protocolo todos os pulsos são entregues na mesma direção, enquanto que no segundo protocolo pulsos são entregues mudando alternadamente a direção do campo elétrico e de orientação. O segundo protocolo só pode ser usado com gerador de pulsos adequado, que permite a aplicação de impulsos elétricos em direções diferentes.
5. Imediatamente após a aplicação do pulso de transferência de células de ponta da pipeta em 6 prato bem e adicionar soro fetal bovino (FCS-Sigma, EUA) (25% do volume da amostra).
6. Incubar as células por 5 minutos a 37 ° C para permitir a recolagem membrana celular.
7. Adicionar 2 ml de HAM-F12 para cada amostra em 6 bem e incubar as células por 24h a 37 ° C em um 5% CO ₂ umidificado atmosfera na incubadora.

. Figura 2 protocolos de campo elétrico: (a) todos os pulsos são entregues na mesma direção, (b) pulsos são entregues mudando alternadamente a direção do campo elétrico e de orientação.

4. Aquisição de imagem e determinação do gene eficácia electrotransfer

1. Eficácia do gene electrotransfer é determinada como a porcentagem de células expressando GFP 24h após a aplicação do pulso.
2. As células são observados usando um microscópio de fluorescência (no nosso caso Zeiss 200, Axiovert, ZR Alemanha), com luz de excitação a 488 nm gerada com um sistema monocromador (policromos IV, Visitron, Alemanha) e de emissões é detectada em 507 nm. As imagens são gravadas utilizando imagens do sistema (Metamorph imagem do sistema, Visitrna, Alemanha), mas o software de aquisição semelhante também pode ser usado.
3. Adquirir pelo menos cinco imagens (contraste de fase e fluorescência verde) com ampliação de 20x objetivo.
4. Contagem de células à imagem de contraste de fase e células que estão expressando GFP à imagem de fluorescência verde. Determinar a percentagem de eficácia electrotransfer gene pela divisão do número de células que estão expressando GFP com o número de todas as células em cada imagem correspondente (Figura 3).

5. Resultados representativos:

Figura 3. A porcentagem de células expressando GFP, quando todos os pulsos são entregues na mesma direção e quando os pulsos são entregues mudando alternadamente a direção do campo elétrico e de orientação é apresentada. As células foram expostas a um trem de oito pulsos com amplitude 225 V, 1 ms de duração e freqüência de repetição de 1 Hz. Resultados foram obtidos por meio de microscopia de fluorescência. Cada valor no gráfico representam a média de três experimentos independentes ± desvio padrão. Mudando a direção do campo elétrico e orientação a porcentagem de células expressando GFP aumenta.

Discussão

Gene electrotransfer é uma técnica de biotecnologia versátil que permite a transferência de DNA em células por meio de aplicação de curto, pulsos de alta tensão elétrica ³ e representa uma alternativa mais segura para vetores virais, devido à sua eficácia, segurança e facilidade de aplicação. Embora electrotransfer gene hoje é amplamente utilizado para transfecção todos os tipos de células e primeira fase I de ensaios clínicos utilizando este método tem sido relatada ^4, os mecanismos subjacentes ai...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
HAM-F12	PAA	E15-016	meio de cultura
L-glutamina	Sigma-Aldrich	G7513
soro fetal bovino	PAA	A15-151
gentamicina	Sigma-Aldrich	G1397	antibiótico
crystacilin	Pliva	625110	antibiótico
pEGFP-N1	Clontech Laboratories	6085-1	DNA plasmidial
Kit Maxi HiSpeed ​​Plasmid	Qiagen	12662
Na 2 HPO 4	Merck	F640786 933
NaH 2 PO 4	TKI Hrastnik	0795
MgCl 2	Sigma-Aldrich	M-8266
sacarose	Sigma-Aldrich	16104
tripsina / EDTA	Sigma-Aldrich	T4174
pipeta ponta	Feitos
elétrica do gerador de pulsos	Feitos
6 Placa bem	TPP	92406
15 tubo de centrifugação ml	TPP	91015
75 centímetros frasco de cultura 2	TPP	90076