Um Ensaio de sangue Funcional inteiro para medir a viabilidade de micobactérias, utilizando-Reporter Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Resumo

Descrevemos uma abordagem alternativa para a enumeração de micobactérias In vitro, Que usa repórter gene-tagged micobactérias em vez de unidades formadoras de colônia (UFC). "Survival" de organismos, bem como anfitrião-resposta marcadores são medidos simultaneamente, proporcionando um sistema de baixo custo, versátil e funcional para os estudos de host / patógeno interações no contexto da tuberculose.

Resumo

Ensaios funcionais há muito tempo desempenhou um papel fundamental na medição da imunogenicidade de uma vacina dada. Este é convencionalmente expressa como soro títulos bactericida. Estudos de soro títulos bactericida em resposta a vacinas infantis nos permitiram desenvolver e validar níveis de corte para respostas imunes protetoras e tal cut-offs estão em uso rotineiro. Sem tais ensaios foram levadas adiante na avaliação de rotina de vacinas que induzem principalmente a imunidade mediada por células em forma de respostas de células T efetoras, tais como vacinas contra a tuberculose. No modelo animal, o desempenho de um candidato a vacina dada é rotineiramente avaliada em ensaios padronizados bactericida, e todos os atuais romance TB vacina candidatos foram submetidos a esta etapa na sua avaliação antes da fase 1 de testes em humanos. A avaliação da imunogenicidade e, portanto, a probabilidade de eficácia protectora do romance de vacinas anti-TB deve idealmente submetidos a uma avaliação por etapas semelhantes nos modelos humanos agora, incluindo medidas em ensaios bactericida.

Ensaios bactericida no contexto da pesquisa vacina contra a tuberculose já estão bem estabelecidos em modelos animais, onde eles são aplicados a tela de vacinas candidatas potencialmente promissoras. Redução da carga bacteriana em várias funções órgãos como a principal leitura de imunogenicidade. No entanto, nenhum de tais ensaios foram incorporados ensaios clínicos para novos medicamentos anti-TB vacinas até o momento.

Embora ainda haja incerteza sobre os mecanismos exatos que levam à morte de micobactérias no interior dos macrófagos humanos, a interação de macrófagos e células T com micobactérias é claramente necessária. O ensaio descrito neste trabalho representa uma geração nova de ensaios bactericida que permite estudos de tal chave componentes celulares com todos os outros fatores celular e humoral presentes no sangue inteiro sem fazer suposições sobre sua contribuição relativa individual. O ensaio descrito pelo nosso grupo utiliza pequenos volumes de sangue total e já foi empregada em estudos com adultos e crianças em TB endêmica configurações. Nós mostramos imunogenicidade da vacina BCG, aumento do crescimento de micobactérias em pacientes HIV-positivos, bem como o efeito da terapia anti-retroviral e vitamina D sobre a sobrevivência de micobactérias in vitro. Aqui resumimos a metodologia e apresentar os nossos dados de reprodutibilidade usando este modelo relativamente simples, de baixo custo e de campo-friendly.

Nota: Definições / Abreviaturas

BCG lux = M. bovis BCG, cepa Montreal, transformada com pSMT1 shuttle plasmídeo carregando a genes de Vibrio harveyi luxAB, sob o controle do GroEL micobactérias (Hsp60) promotor.
UFC = Unidade Colony Forming (uma medida de viabilidade de micobactérias).

Protocolo

1. Preparação de BCG estoque repórter lux micobactérias

1. Crescer BCG lux (M. bovis BCG cepa Montreal transformado com o plasmídeo pSMT1 shuttle) com agitação a 200 rpm até meados de logarítmica fase em Middlebrook 7H9 caldo contendo 0,2% de glicerol, 0,05% entre 80 e 10% de enriquecimento ADC.
2. Prepare 1 ml de uma diluição de 1:10 de BCG cultura lux em PBS estéril em um tubo de luminômetro (900μl de PBS + 100μl BCG cultura lux) em duplicata.
3. Carga tubo contendo N-decyl aldeído (substrato da enzima luciferase) na parte traseira da máquina e garantir a tampa é presa e tubos no local.
4. Primeiro luminômetro injector com substrato através do programa principal, definido para injectar 100 ucl x 3 em cada um dos três tubos de priming vazias colocadas no luminômetro.
5. Carregar os dois tubos no luminômetro e fazer leituras através de um programa conjunto de injectar 100 ucl de substrato em cada tubo e ler por 20 segundos em intervalos de 1 seg.
6. Quando o estoque atingiu 1x10 ⁸ RLU / ml a 2x10 ⁸ RLU / ml (isso leva cerca de 3-4 dias de crescimento), adicionar igual volume de glicerol 30% estéril para a cultura em um tubo falcon de 50ml e misture delicadamente.
7. Alíquota de 1,5 ml em volumes rotulados microtubo tampa de rosca 2 ml e armazenar a -80 ° C.

2. Determinar ações RLU / UFC correlação e conteúdo de alíquotas

1. Adicionar 15ml de Middlebrook 7H9 meio de cultura com 10% de suplemento ADC para um balão Erlenmeyer 200ml com tampa ventilada.
2. Adicionar 15μl de higromicina e 30μl de Tween 20%.
3. Remover um frasco de BCG lux do freezer e descongele em temperatura ambiente (RT) no gabinete de segurança. Adicionar o conteúdo do frasco para o meio e apertar a tampa.
4. Incube com agitação a 200 rpm a 37 ° C por 4 dias.
5. Em cada dia, tornar-se série de 10 diluições (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 e 1:100.000) para determinação UFC.
6. Configurar as diluições mesmo em paralelo e duplicar para determinar luminescência (ver parte 1,2-1,6).
7. Prepare dois 3 compartimentos placas de ágar Middlebrook 7H11 (1 l de meio líquido contendo glicerol 0,5%, 10% suplemento OADC, 1 ml de Tween 20% e 1 ml de higromicina).
8. Placa fora 100μl de cada diluição em um segmento de cada placa usando propagadores separadas, distribuindo o líquido igualmente através da câmara individual.
9. Selar cada placa com parafilme, coloque em um saco plástico estéril, vedação com fita autoclave, e incubar a 37 ° C por 2 semanas com tampa virada para baixo.
10. Inspecionar regularmente até aparecer UFC (2-3 semanas).
11. Para contar colônias, retire as placas da incubadora e coloque em um contador de colônias. Calcular a média para cada diluição das placas duplicadas.
12. Calcular a relação RLU / UFC usando RLU equivalentes e contagem de CFU para cada diluição. A relação deve estar entre 3 e 5 RLU / UFC.

3. Preparação de BCG cultura lux para inoculação em sangue total

1. Adicionar 15ml de Middlebrook 7H9 meio de cultura com 10% de suplemento ADC para um balão Erlenmeyer 200ml com tampa ventilada.
2. Adicionar 15μl de higromicina e 30μl de Tween 20%.
3. Remover um frasco de BCG lux do freezer e descongele em temperatura ambiente no gabinete de segurança. Adicionar o conteúdo do frasco para o meio e apertar a tampa.
4. Incube com agitação a 200 rpm a 37 ° C durante 2 a 4 dias.
5. Prepare 1 ml de uma diluição de 1:10 de BCG cultura lux em PBS estéril em um tubo de luminômetro (900μl de PBS + 100μl BCG cultura lux) em duplicata.
6. Luminômetro privilegiada, com substrato (como descrito acima), gentilmente vortex os 2 tubos e carregar no luminômetro e fazer leituras (como descrito acima).
7. Use esta leitura para diluir até a cultura em PBS para dar o equivalente a 7x10 ⁶ RLU (isso vai dar um inóculo de cerca de 2x10 ⁵ de sangue UFC / ml e um rácio de BCG para os monócitos de cerca de 1:1, assumindo uma contagem de monócitos de cerca de 2x10 ⁵ a 4x10 ⁵ monócitos por ml de sangue).

4. Preparação de sangue total

1. Levar de 3 a 5 ml de sangue venoso em tubo contendo heparina sem conservantes.
2. Transferir o sangue para um tubo falcon de 50ml e diluir com um volume igual de RPMI 1640 contendo HEPES glutamina e 25mm (sem pen / strep).
3. Alíquota de 900μl de sangue diluída em triplicata em tubos estéreis bijou para cada ponto de tempo (6 tubos no total:. 3 para 0hrs e 3 para 96h Configure tubos adicionais para timepoints adicionais, se necessário.
4. Alíquota de 900μl Middlebrooks meio de cultura 7H9 com 10% ADC suplemento + 50μg/ml higromicina (mesmo meio utilizado para a cultura da BCG lux) em duplicata para os controles de crescimento.
5. Adicionar 100μl do BCG diluído lux a cada tubo de sangue, e para o controle de duas crescimentotubos.
6. Misture bem e coloque os 3 bijous 96h para o ponto do tempo e os 2 controla o crescimento do seu lado na incubadora de balanço a 37 ° C, 20 rev / min (CO ₂ não obrigatório).

5. Luminescência de medição (em 0hr e 96h)

1. Centrifugar a 3 bijous em 2000g por 10 min.
2. Remova cuidadosamente 300 ul do sobrenadante sem perturbar o sedimento e coloque em 2ml tampa de rosca microtubos para congelar a -80 ° C para análise de citocinas subseqüentes.
3. Adicionar 300 ul de PBS a cada bijou para substituir o volume de sobrenadante removido.
4. Aspirar o conteúdo de cada bijou para a correspondente tubo falcon de 50ml e adicionar água destilada a cada tubo de 8ml. Iniciar um temporizador de 10 min.
   NB: Este é um passo sensíveis ao tempo, e esta incubação não deve ser qualquer mais de 10 min, começando a partir de quando as primeiras células entram em contato com a água.
5. Enxaguar cada bijou com 2 ml de água destilada e vortex por 5 segundos antes de derrubar para dentro do tubo falcon correspondente.
6. No final da incubação de 10 minutos, centrifugar os tubos falcon de 2000g por 10 minutos.
7. Decantar o sobrenadante em desinfetante Surfanios.
8. Adicionar algumas esferas de vidro a cada pellet e vortex.
9. Adicionar 1 ml de PBS estéril para cada tubo e vortex.
10. Em tubos luminômetro, fazer diluições 1:10 de cada amostra em duplicata com PBS (amostra + 900μl PBS 100μl) e no tempo 96h-ponto. Fazer as diluições mesmo para cada um dos controles de crescimento.
11. Suavemente os tubos vortex e carregar no luminômetro e fazer leituras (como descrito acima)
    Nb: Leituras entre triplicatas de uma mesma amostra deve ser de 15% uma da outra.

6. Resultados representativos:

É importante o uso de bactérias na fase logarítmica de crescimento para os ensaios de sangue total lux, ou seja, cresceu mais de 48-72 horas antes da inoculação das amostras, como atividade metabólica é suboptimal se qualquer direto para fora do freezer ou em fase estacionária. O crescimento, antes deve ser padronizado para uma série de experimentos a 48 ou 72 horas para evitar a variabilidade. A Figura 1 mostra a curva de crescimento de uma cultura representativa da BCG lux. O tempo de duplicação é de cerca de 24 horas até fase estacionária é alcançado.

Figura 1. Curva de crescimento Representante do BCG lux mais de 96 horas em meio 7H9 e correlação de RLU e UFC.

Embora os valores de RLU sempre se correlacionam com UFC, o número de RLU correspondente a um único UFC pode variar dependendo do estoque, que é por isso que é boa prática usar o mesmo estoque congelado durante uma série de experimentos para garantir uma multiplicidade consistente de infecção ( MOI).

A Tabela 1 mostra um exemplo de data-primas no momento da inoculação (T ₀₎ e em 96 horas. Os rácios de crescimento são calculadas usando a fórmula T ₉₆ / T _0, mas outros intervalos de tempo, claro, também pode ser medido. É, no entanto, não aconselhável a utilização de culturas para além das 96 horas, como a morte celular significativa ocorra.

Tabela 1. Exemplo de dados brutos em tempo de inoculação (T0) e em 96 horas (T96) e rácios de crescimento calculados a partir de 3 dadores adultos.

Dependendo do antígeno específico disponível respostas de memória ea contagem de neutrófilos, possivelmente, também, os rácios de crescimento variam entre indivíduos, como mostrado aqui na Figura 2 no sangue de crianças com e sem infecção pelo HIV. Em média, as crianças têm maiores taxas de crescimento do que os adultos, teste tuberculínico (TST) + ve indivíduos têm relações um crescimento inferior ao TST ve-indivíduos, e pacientes infectados pelo HIV tem rácios de crescimento devido à deficiência da população de células CD4 T, um dos principais mediadores da resposta imune celular de micobactérias.

Figura 2 Inter-doador variabilidade:. Índices de crescimento de T ₀ versus 96 horas de um conjunto de pacientes, dependendo do estado HIV subjacente.

Reprodutibilidade dos índices de crescimento ao longo de um período de tempo é mostrado na Figura 3, que resume os resultados de 64 doadores sangrou duas vezes durante um período de 12 meses e de um único doador sangrou várias vezes para experimentos de controle. Causas potenciais de variabilidade podem ser mudanças na sensibilização por micobactérias ou variabilidade dentro de níveis de citocinas host, como observado em bioensaios de muitos.

Figura 3. (A) único doador em 12 ocasiões em 12 meses. (B) múltiplas (64) doadores em 2 ocasiões com mais de 12 meses.

Discussão

Ensaios bactericida no contexto da pesquisa vacina contra a tuberculose estão bem estabelecidos em modelos animais, onde são aplicados para a tela vacinas candidatas potencialmente promissoras. Redução da carga bacteriana em várias funções órgãos como a principal leitura de imunogenicidade.

A primeira geração de humanos ensaios bactericida foram projetados usando macrófagos sozinho, infectados com M. tuberculose. CFU serviu como a principal leitura de sobrevivência de micobactérias ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente	Companhia	Cat Não
BCG lux	Vários	n / a
Middlebrook 7H11 agar	Becton Dickinson	283810
Middlebrook 7H9 caldo	BD Biosciences	271310 (500g)
Middlebrook enriquecimento ADC	BD Biosciences	212352
Middlebrook suplemento OADC	Becton Dickinson	212240
Tween 80	Sigma Aldrich	274364
Glicerina	Sigma Aldrich	G5150
Higromicina B	Roche	10843555001 (20ml)
N-decyl aldeído	Sigma	D7384-100G
Etanol (> 99,7%)	VWR	101077
PBS estéril	Em Casa	n / a
RPMI-1640 com HEPES, L-Glutamina 25mM	Sigma	R0883
Água destilada estéril	Em Casa	n / a
Equipamento
Luminômetro tubo (porta injetável obrigatório)	Berthold AutoLumat LB953 ou single-tubo luminômetro Sirius
Tubos luminômetro, 12 x 75mm, pirex sem aro	Corning da VWR	99445-12
Erlenmeyers com tampas ventiladas, estéril policarbonato 250ml	Corning via Fisher Scientific	2150329
BD Vacutainer Sangue Coleta Tubes (isenta de conservantes heparina)	BD	367676
Falcon 50ml tubos, cônico	BD	352077
7ml espécime STERILIN polipropileno bijou tubos	VWR	99445-12
STERILIN Universal recipientes (30 ml)	Laboratório de Análises LTD	128C
Contas de vidro 2mm de diâmetro	SigmaAldrich	Z143928
10ml pipetas e um menino de pipeta	qualquer
1000μl e 200μl pipetas e pontas com filtro	qualquer
Equipamento geral de laboratório:
Classe II de segurança gabinete gabinete
Geladeira (4 ° C)
Centrifugador
Rocking shaker plataforma (180 0) para misturar os tubos
Orbital Shaker incubadora a 37 ° C para crescer culturas bacterianas