Uma Introdução à Vespas parasitas de<em&gt; Drosophila</em&gt; E Resposta Imune a antiparasitários

Resumo

Parasitóide (parasita) vespas constituem uma classe importante de inimigos naturais de insetos, incluindo muitos Drosophila melanogaster. Vamos introduzir as técnicas para propagar estes parasitas em Drosophila Spp. e demonstrar como analisar seus efeitos sobre os tecidos imunes de Drosophila Larvas.

Resumo

A maioria das espécies conhecidas de vespas parasitoides ataca as fases larval ou pupal de Drosophila. Enquanto Trichopria drosophilae infecta as fases pupais do hospedeiro (Fig. 1A-C), fêmeas do gênero Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) e Ganaspis (Fig. 1E) atacam as fases larvais. Utilizamos esses parasitas para estudar a base molecular de uma corrida armamentista biológica. As vespas parasitas possuem grande valor como agentes de controle biológico. A maioria delas carrega fatores de virulência e outros que modificam a fisiologia e a imunidade do hospedeiro. A análise das vespas de Drosophila está fornecendo informações sobre como interações específicas entre espécies moldam as estruturas genéticas de comunidades naturais. Esses estudos também servem como modelo para compreender a fisiologia imunológica dos hospedeiros e como reações imunes coordenadas são frustradas por essa classe de parasitas.

A cutícula larval/pupal atua como a primeira linha de defesa. O ovipositor da vespa é uma estrutura afiada, semelhante a uma agulha, que entrega eficientemente os ovos no hemocélio do hospedeiro. Após a oviposição, ocorre uma reação de cicatrização no local da lesão na cutícula (Fig. 1C, cabeças de seta). Algumas vespas podem inserir dois ou mais ovos no mesmo hospedeiro, embora apenas o desenvolvimento de um único ovo prossiga com sucesso. Ovos supranumerários ou larvas em desenvolvimento são eliminados por um processo ainda não compreendido. Por esse motivo, essas vespas são denominadas parasitoides solitárias.

Dependendo da linhagem da mosca e da espécie de vespa, o ovo da vespa tem um de dois destinos. Ele é encapsulado, bloqueando seu desenvolvimento (surgimento do hospedeiro; Fig. 2 esquerda); ou o ovo da vespa eclode, desenvolve-se, muda de exoesqueleto e cresce até se tornar um adulto (surgimento da vespa; Fig. 2 direita). L. heterotoma é uma das espécies mais bem estudadas de vespas parasitas de Drosophila. Trata-se de uma "generalista", o que significa que pode utilizar a maioria das espécies de Drosophila como hospedeiras¹. L. heterotoma e L. victoriae são espécies irmãs e produzem partículas semelhantes a vírus que interferem ativamente na resposta de encapsulação². Diferentemente de L. heterotoma, L. boulardi é um parasita especialista e o espectro de espécies de Drosophila que utiliza é relativamente limitado¹. Linhagens de L. boulardi também produzem partículas semelhantes a vírus³, embora diferem significativamente em sua capacidade de sucesso em D. melanogaster¹. Algumas dessas linhagens de L. boulardi são difíceis de cultivar em D. melanogaster¹, já que o hospedeiro frequentemente consegue encapsular seus ovos. Assim, é importante conhecer ambas as partes envolvidas em protocolos experimentais específicos.

Além dos tecidos de barreira (cutícula, intestino e traqueia), as larvas de Drosophila possuem respostas imunes sistêmicas celulares e humorais que decorrem das funções das células sanguíneas e do corpo gorduroso, respectivamente. A oviposição por L. boulardi ativa ambos os braços imunes^1,4. As células sanguíneas são encontradas em circulação, em populações sésseis sob a cutícula segmentada e na glândula linfática. A glândula linfática é um pequeno órgão hematopoiético localizado na face dorsal da larva. Aglomerados de células hematopoiéticas, denominados lóbulos, estão dispostos segmentalmente em pares ao longo do vaso dorsal, que se estende ao longo do eixo anterior-posterior do animal (Fig. 3A). O corpo gorduroso é um grande órgão multifuncional (Fig. 3B). Ele secreta peptídeos antimicrobianos em resposta a infecções microbianas e metazoárias.

A infecção por vespas ativa a sinalização imune (Fig. 4)⁴. Ao nível celular, ela induz a divisão e diferenciação de células sanguíneas. Em defesa própria, agregados e cápsulas se desenvolvem no hemocélio de animais infectados (Fig. 5)^5,6. Células sanguíneas ativadas migram em direção ao ovo da vespa (ou larva da vespa) e começam a formar uma cápsula ao seu redor (Fig. 5A-F). Algumas células sanguíneas se agregam para formar nódulos (Fig. 5G-H). Uma análise cuidadosa revela que a infecção por vespas induz os lóbulos mais anteriores da glândula linfática a se dispersarem em suas periferias (Fig. 6C, D).

Apresentamos dados representativos com componentes da via de transdução de sinal Toll, Dorsal e Spätzle (Figs. 4,5,7), e seu gene alvo Drosomycin (Fig. 6), para ilustrar como alterações específicas na glândula linfóide e no hemocela podem ser estudadas após infecção por vespas. Os protocolos de dissecação descritos aqui também permitem obter os ovos de vespas (ou estágios em desenvolvimento de vespas) do hemolinfa do hospedeiro (Fig. 8).

Protocolo

Todo o protocolo para a experiência é dividido em quatro passos (Fig. 9). (1) Cultivar vespas em larvas de mosca, (2) Configurando infecções e preparar o animal para dissecção, (3) Isolamento e fixação hospedeiro / agente estruturas; (4) Analisando os tecidos imunes.

1. Vespas cultura sobre larvas de Drosophila

Manutenção de culturas de vespas requer um planejamento cuidadoso. Em relação ao moscas em crescimento, é bastante trabalhosa. Mantemos nossas colônias da vespa em laboratório de larvas ou pupas da linhagem de Drosophila yw a 24 ° C. Vespas cultura envolve manter uma fonte contínua de anfitriões na fase certa e limpar os "infectados" frascos de moscas que surgem antes que as vespas fazem. Vespas seguir o método de determinação do sexo haplodiploid e por isso é importante que as fêmeas são acasaladas antes que eles infectem os anfitriões.

1. No dia 1, adicionar uma pequena bagatela de recém-précolar de levedura preparado (feita misturando 1 ml de água em cerca de 1 g de levedura seca activa para um frasco de fresco mosca alimento A receita do alimento mosca não é crítica;. que crescem no meio de moscas corn-meal/sucrose/agar. o local de 50-60 jovens (2-4 dias de idade) yw adulto (ou estirpe de tipo selvagem outro essencialmente) voa a pôr ovos durante 48 horas a 24 ° C.
2. No dia 3, remover as moscas dos frascos. Colocar um tampão zumbido no frasco com uma gota de mel no lado interior da ficha de zumbido. Mel é diluído 2:01 em água destilada.
3. Usando CO _2, anestesiar as vespas fêmeas e classificar 6-8 e 6-8 machos que são cerca de 2-3 dias de idade. Adicione-os ao frasco que contém 0-48 horas anfitriões de idade. Observe que as vespas são mais sensíveis às emissões de CO ₂ do que as moscas, e você pode ter que calibrar a sua exposição ao gás. Pesquisadores de Drosophila não usar um padrão Drosophila projeto da estação de anestesia. Um bom ponto de partida para anestesiar vespas é para ajustar a pressão _de CO ₂para cerca de metade do que é necessário para anestesiar moscas.
4. Recoloque o plugue do zumbido (com mel) no frasco. Delicadamente, coloque o frasco de lado até as vespas acordar.
5. Coloque esses frascos com larvas de moscas e vespas em 24 ° C incubadora.
6. Infecções bem sucedidas irá atrasar pupariation ligeiramente. Hosts que sofreram ataque de vespa, mas são capazes de se defender (ou se eles não estão infectados), continuar o desenvolvimento seguindo o cronograma normal e moscas adultas emergem destas pupários bem à frente das vespas.
7. Dependendo da espécie de vespa e temperatura, vespas eclose em 25-30 dias.
8. Retire as moscas adultas a partir dos frascos em que as vespas estão em desenvolvimento.

2. Configurando Infecções e Preparação animais infectados para Dissecção

Antes de começar, ter um casal de vidro limpo ou placas de Petri de plástico, um pirex dissecando com 9 depressões, Kimwipes, água destilada (em uma garrafa de esguicho), 70% de etanol (em uma garrafa de esguicho), 1X PBS (em uma garrafa de esguicho), lâminas de microscópio, e uma espátula, pequena limpo à mão.

1. Para configurar infecções, siga os passos 1-5 acima. Dependendo do experimento, pode ser necessário usar hospedeiros que são mais ou menos no mesmo estádio de desenvolvimento. Para isso, egglays de 2-6 horas pode ser usado para a infecção.
2. Para colher larvas infectadas (para dissecção de tecidos imunes ou parasitas), remova o conteúdo dos frascos de mosca em um copo pequeno ou placa de Petri de plástico.
3. Usando um estereomicroscópio e fórceps finos (pinças), cuidadosamente escolher 6-10 larvas, um por um, e colocá-los em uma depressão bem com PBS 1X em primeiro lugar, depois transferi-los em água, etanol a 70%, água, e 1X PBS, sucessivamente. O objectivo destas medidas é libertar os animais do alimento rapidamente e completamente limpar e esterilizar sua superfície. A lavagem em água dilui o etanol ea lavagem final em PBS remove o etanol. Para o Passo 3 abaixo, não é o melhor deixar oanimais em PBS durante mais de 10 minutos.

3. Isolar e Fixação de host / parasite Estruturas

Fundo

A glândula linfática larval é um pequeno órgão hematopoiético ^7. No terceiro estádio larval, o gânglio linfático contém uma grande par de lóbulos anteriores que flanqueiam o vaso dorsal (Fig. 3A, 6B-C, 7A-D). Os lóbulos anteriores são divididos em regiões especializadas com propriedades únicas células ^7. Progenitores de três tipos de células, plasmatócitos, lamellocytes, e células de cristal residem nos lóbulos anteriores. Células pericárdicas separar os lóbulos anterior a partir da lóbulos menores posteriores. A glândula linfática Drosophila é um modelo para a hematopoiese insetos e mamíferos ^8,9.

De gordura corporal é funcionalmente semelhante ao fígado dos mamíferos. A resposta humoral é desencadeada no microbiana gordura corporal seguinte ou infecção vespa ^1,4,10. Comoum resultado, uma combinação única de genes de péptidos antimicrobianos são activados e os péptidos são secretados para o hemolinfa ^1. O corpo de gordura é também o tecido primário para glicogénio e triglicéridos de produção e de armazenamento ^11. O corpo de larvas de gordura ocupa um volume substancial da hemocele e, portanto, ao contrário do gânglio linfático, é fácil de localizar. Vamos agora demonstrar como dissecar a glândula linfática e da gordura corporal a partir de larvas de terceiro estádio.

Antes de começar

Necessita de pinça fina (pinças) e etanol limpos lâminas de microscópio.

Dissecção da glândula linfática larval

1. Utilizando uma pinça fina, selecione um errante larva de terceiro ínstar mantidas em 1X PBS.
2. Coloque a larva sobre uma lâmina de microscópio.
3. Usando uma pinça, a posição do animal com o lado ventral para cima.
4. O uso de dois pares de pinças, segurar o animal em cada lado da extremidade posterior (pontas de seta 1, fig. 3A) e gcantes puxar a cutícula para introduzir uma lágrima, pequena superficial na cutícula.
5. A hemolinfa contendo hemócitos, intestino, e gordura corporal começará a escapar da cavidade do corpo. A hemolinfa podem ser tomadas com uma 10 uL "pipetteman" para fazer esfregaços, se necessário.
6. Colocando as duas pinças, no lado direito do animal sob os ganchos da boca (pontas de seta 2, fig. 3A), suavemente rasgar a cutícula.
7. Mover ambos os fórceps para o lado esquerdo do animal sob os ganchos da boca (pontas de seta 2, fig. 3A) e cuidadosamente fazer uma outra pequena lágrima.
8. Enquanto segura a boca ganchos do animal, puxe a cutícula para baixo em direção à extremidade posterior do animal (como se descascando-lo de volta).
9. À medida que a cutícula é puxado para trás, o cérebro, de gordura corporal, discos imaginais, glândulas salivares, e proventrículo ficará exposta. A cutícula desanexada está agora na extremidade posterior, mas ainda terá o vaso dorsal com a glândula linfática ligado a ele.
10. Corte o proventrículo e movê-lo para longe da área da glândula linfática. A glândula linfática será debaixo do cérebro, mesmo que você não pode ser capaz de vê-lo.
11. Cuidadosamente arreliar fora a gordura corporal, intestino, glândulas salivares, e outras estruturas que podem estar sentados na glândula. Ter cuidado para não separar o gânglio linfático a partir da glândula anel eo vaso dorsal localizado posterior para o cérebro. A glândula linfa será posicionado plana contra a lâmina de microscópio.
12. Retire cuidadosamente todos os outros tecidos fora da glândula linfática até toda a glândula se desenvolve a partir dos lobos anterior ao último conjunto de células do pericárdio.

Nota: A glândula linfa adequadamente dissecados terá um par de lóbulos anteriores e dois conjuntos de lóbulos posterior ao longo do vaso dorsal (Fig. 6B). Os lóbulos pode ser facilmente danificado ou pode cair a partir do vaso dorsal. As amostras devem ser manuseados com muito cuidado. A glândula também hcomo uma tendência a encolher ou contrato. Suavemente endireitar o órgão na sua extremidade posterior permite que todas as partes e as células a ser apresentado bem. Isto é especialmente necessário para os protocolos de imunocoloração.

Fay dissecção corpo

1. Na fase de dissecação da Zeiss 1000 microscópio de dissecação (qualquer estéreo microscópio de dissecção pode ser utilizado), colocar uma caixa de luz que permite que a luz incidente a ser transmitido através da amostra. Posicione uma larva de terceiro estádio do Passo 2 sobre uma lâmina de microscópio em 200 ul de PBS 1X. Inclinar a fonte de luz de distância a partir da amostra de modo a que o organismo aparece transparente e, por conseguinte, é fácil de visualizar os seus órgãos internos.
2. Utilizando uma pinça posição, o animal de modo que a extremidade anterior é longe de você.
3. Utilizando uma pinça, mantenha a cutícula da larva no lado esquerdo de ganchos sua boca (ponta de seta 1, a fig. 3B). Usando a pinça outros, gentilmente rasgar a cutícula todo o caminho até a extremidade posterior (arrowhead 2, Fig. 3B). Não rasgue a cutícula longe do corpo na extremidade posterior.
4. Muito delicadamente iniciar a remoção do intestino para o lado.
5. Remover suavemente o cérebro, os discos imaginais, ea glândula anel com o gânglio linfático correndo através do vaso dorsal.
6. Não remova as glândulas salivares desde há gordura corporal aderir a estas glândulas.
7. Com cuidado, retire a cutícula e deixar o corpo de gordura no slide em 1X PBS.

Nota 1: A gordura corporal tem apenas uma camada de células e é, por conseguinte, importante ter todas as células achatada no mesmo plano sobre a lâmina de vidro. As células são endopolyploid e fácil de visualizar. Uma amostra de corpo bem dissecados de gordura deve manter contactos celulares normais, e deve ter o mínimo de glóbulos de gordura ao redor da amostra dissecado (Fig. 6I, J).

Nota 2: Se os ovos de vespas não são afetados pelo sistema imune do hospedeiro, eles vão initiatdesenvolvimento e quase que imediatamente. Os primeiros estádios de desenvolvimento do parasita (a partir do hospedeiro larva) são facilmente acessíveis a partir do hemocelo dissecado (Fig. 8). Ovos ou larvas de parasitas ou aderir à gordura corporal ou de outros órgãos, ou simplesmente deslizar sobre a lâmina de vidro durante a dissecção.

4. Analisando os tecidos imunes

1. Ar seco gânglios linfáticos durante 5-10 min e remove 1X PBS a partir da corrediça de gordura corporal antes da fixação por 5-10 minutos com paraformaldeído a 4% preparada em PBS. Cada slide pode ter vários gânglios dissecados para a coloração. Mova slides com as amostras fixas em uma câmara caseira umidificado para as etapas subseqüentes. Esta câmara está preparada pela colocação de duas peças de dobradas, toalhas de papel húmidas, na parte inferior de uma caixa de vazio ponta de plástico micropipeta. Um ou mais lâminas com as amostras podem ser colocados na parte superior do divisor utilizado para segurar as pontas.
2. Como tal, a análise dos tecidos imunes é efectuado de acordo com métodos padrão quecombinar na rotulagem celular vivo e ⁴ imunohistoquímica indireta.

5. Os resultados representativos

1. Wasp infecção ativa a expressão do repórter via Toll Drosomycin-GFP (Fig. 6G, J). Nesta experiência, o efeito de vespa de infestação na expressão do gene é visualizada in vivo utilizando um GFP-repórter ligado ao promotor Drs. ^12. Em animais de controlo não infectados, a expressão da GFP não é detectado. O sinal de GFP é claramente detectado no citoplasma e núcleo das células do corpo gordo, dissecados a partir de animais infectados com L. victoriae. Para obter os melhores resultados, a proporção de vespas: hosts devem ser 1:10. A infecção deve durar pelo menos 2 horas. Após a infestação, os Drs. intensifica-GFP sinal e muitas células de gordura corporal são GFP-positivo, mesmo até 72 horas ^1,4.
2. Infecção vespa induz a diferenciação de lamellocytes no lglândula ymph (Fig. 6D). Lamellocytes cercar e impedir o desenvolvimento de vespa (Fig. 6H). Glândulas linfáticas são dissecados para visualizar as alterações celulares induzidas nos lobos anterior após L. victoriae infecção. Recém-diferenciadas lamellocytes estão presentes na periferia dos lóbulos dissecados; lamellocytes são marcados com um transgene GFP que é impulsionada pelo potenciador disforme (MSNF9-GFP). Todas as células são visualizadas com a actina filamentosa utilizando rodamina marcado faloidina. Note-se que a integridade dos lóbulos anteriores é interrompida nessas glândulas como a membrana basal, que normalmente envolve o lobo continuamente (Fig. 6C), é agora descontínuo (Fig. 6D). A partir dos mesmos dissecações, lamellocytes na hemolinfa também pode ser visualizada em esfregaços (Fig. 6G), alguns dos quais estão associados com a estrutura da cápsula formada para bloquear o desenvolvimento do parasita (Fig. 6H).
3. Sproteína pätzle é expressa na maioria das células do gânglio linfático larval (Fig. 7C, D). Para detectar SPZ nos gânglios linfáticos dissecados, seguimos um protocolo padrão para a coloração de células do gânglio linfático com anticorpos policlonais anti-SPZ anticorpos ^4. In vivo, SPZ aumento níveis em células dos gânglios linfáticos após a infecção vespa (compare painéis fig. 7C, E com 7G, I, e 7D painéis, F com 7H, J).
4. Estágios iniciais e finais de desenvolvimento de larvas de vespa de acolhimento e pupas (Fig. 8). Para examinar as fases de desenvolvimento de vespas, lagartas infectadas, são dissecados em momentos diferentes após a oviposição. Aqui nós mostramos uma amostragem dessas etapas de Leptopilina spp. De tipo selvagem infectado D. melanogaster hospeda.

Figura 1. Diferentes espécies de vespas e postura de um ovo de vespa. Todas as imagens foram obtidas utilizando um microscópio estereoscópico Leica. A Trichopria vespa fêmea drosófilas oviposita ovo em um D. melanogaster pupa. Ampliação B de oviposição de Trichopria drosófilas em acolhimento pupa pontos. C melanizadas indicam a cicatrização no local da oviposição. D L. boulardi do sexo masculino. E G. xanthopoda fêmea. F L. victoriae fêmea. G L. heterotoma macho (à esquerda) e fêmea.

Figura 2. Os ciclos de vida que mostram a mosca / vespa corrida armamentista. Resultados de oviposição em um dos dois resultados. As reacções quer imune do hospedeiro ter sucesso para bloquear o desenvolvimento da vespa (à esquerda), ou a vespa frustra respo imune do hospedeiroNSES e consegue (à direita). Modificado de Melk e Govind, 1999 ^18.

Figura 3. Larvas terceiro instar mostrando os órgãos de interesse antes de dissecção. Todas as imagens foram obtidas usando um estereomicroscópio Leica. Um hml> larva GFP com GFP (verde) de fluorescência (seta) em células individuais do gânglio linfático indica a localização geral do gânglio linfático em um animal intacto. A larva foi fotografada com lentes de campo de fluorescência e brilhante. Pontas de seta aponta para locais importantes para o protocolo de dissecção linfa glândula descrito no texto. B Cg> larva GFP com GFP expressão na gordura corporal para indicar a localização do órgão em um Anim intactaai. Pontas de seta aponta para locais importantes para o protocolo de gordura corporal dissecção descrito no texto.

Figura 4. Imuno-circuito genético da resposta imune do hospedeiro contra os componentes principais parasitóides ataque. Da via Toll são mostrados. Spätzle (SPZ) é ativado pela enzima protease processamento Spätzle, SPE. Ativado SPZ serve como ligante para Toll. Sinalização intracelular leva à ativação de fatores de transcrição NF-kB, dorsal e Dif. Cacto serve como inibidor da via do IkB. Activação do Drosomycin, uma canónicas Ligação do gene alvo via, pode ser monitorizado utilizando linhagens de moscas transgénicas com o repórter da GFP (ver fig. 6I, J).

Figura 5. A encapsulação em resposta a L. infestação em victoriaeHospedeiros Serpent> GFP-dl de Drosophila. Um potenciador do gene da serpente é expressa em células de sangue ^13. Quando este potenciador dirige a expressão da proteína de fusão GFP-dorsal em um transgene, dorsal é detectado através da fluorescência verde da GFP em alguns plasmatócitos e lamellocytes que compõem as cápsulas e agregados. Todas as imagens foram obtidas utilizando um microscópio Zeiss LSM confocal. Um ovo de L. ampliações Lamellocytes victoriae. BD (setas brancas) na extremidade posterior do expresso ovo GFP-dorsal. Cd maior da amostra no painel B. EH amostras são contrastadas com rodamina-faloidina marcado para visualizar actina filamentosa (F-actina, vermelho) e com Hoechst 33258 para visualizar o DNA (azul). E Encapsulated ovo de L. victoriae. cápsula F melanizadas de L. victoriae. GH L. victoriae INFEction induz células do sangue (plasmatócito e lamellocyte) agregação.

Figura 6. As respostas imunes contra a infecção de vespa. Imagens em painéis A e B foram obtidos usando um Zeiss Axio Scope. Imagens em painéis CJ foram obtidos utilizando um microscópio confocal Zeiss LSM. Uma larva Anfitrião mostrando ovo de vespa melanizadas encapsulado (seta) através da cutícula transparente. B Representante terceiro instar larval glândula linfática corados com Hoechst 33258 revela células de todos os lobos e intercalados células pericárdicas. Barra de escala representa 100 μ. CJ Todas as amostras foram contrastadas com Hoechst 33258 (para núcleos rótulo) e faloidina rodamina (para rotular F-actina). CD Anterior lóbulos linfáticos glândula de controle (C) e L. victoriae infectadas (D) MSNF9-GFP animais. Nos animais infectados, expressão MSNF enhancer, específicos para lamellocytes ^14, é detectada com um repórter da GFP nuclear. Plasmatócitos E isoladas a partir de animais não infectados não expressam GFP. Estes animais têm muito poucos ou nenhuns lamellocytes. F Plasmatócitos (GFP-negativo seta curta) e recém-diferenciados, lamellocytes maiores (setas longas) com expressão GFP nuclear fraca de L. victoriae infectado MSNF9-GFP larva. plasmatócitos G livres e agregados e lamellocytes da hemocele de um L. victoriae infectado larva Drs.-GFP. Expressão do repórter Drs.-GFP é activado em alguns plasmatócitos (seta pequena), mas não em lamellocytes (setas longas) pós-infecção. H encapsulados e larva vespa melanizados de L. boulardi-infectados MSNF9-GFP larva hospedeira. Numerosos MSNF9-GFP positivas lamelloctyes cercam a larva da vespa (estrutura escuro; seta grossa) e exibem expressão GFP forte nuclear (setas longas). Esta panel anteriormente publicado no PLoS One ^15. células do corpo IJ gordos dissecado a partir de não infectado (I) e L. victoriae-infectado (J) larva Drs.-GFP. GFP é nuclear e citoplasmática em células de gordura corporal de animais infectados. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 7. Spätzle expressão após a infecção vespa parasitóide. As amostras foram contra AJ com Hoechst 33258 para visualizar DNA. Todas as imagens foram obtidas utilizando um microscópio Zeiss LSM confocal. Lobos AF Anterior dissecados a partir de larvas yw não infectada. As amostras foram processadas para imunocoloração indirecta sem anticorpo primário (A e B) ou com anti-SPZ anticorpo (vermelho; C, D, E, F) e contrastadas com Alexa Farinha faloidina-a etiqueta F-actina em células (verde;. B, D, F) lobos GJ Anterior dissecados a partir de larvas yw infectado e corados com anticorpo anti-SPZ (vermelho, G, H, I, J) e Alexa Fluor-faloidina (verde; painéis. H, J) EF ampliações mais elevadas de amostras em C e D, respectivamente ampliações. IJ mais elevadas das amostras em G e H, respectivamente. Barras de escala em painéis de AD, G, H representam 50 um.

Figura 8. Fases de larva e pupa de L. heterotoma e L. boulardi. fases individuais foram isolados a partir de larvas ou de pupas infestação pós mosca hospedeiros, como indicado. Todas as imagens foram obtidas utilizando um Zeiss Axio Scope. Top linha AF L. estágios heterotoma, 1-6 dias após a infecção. inferior linha AF pós-embrionário L. estágios boulardi, 4 a 12 dias após infecção.

Figura 9. Fluxograma do protocolo experimental.

Discussão

Interesse em vespas parasitas de Drosophila está surgindo como técnicas moleculares para decodificar genomas inteiros se tornar eficiente e rentável. No entanto, em relação aos seus excepcionalmente bem estudadas anfitriões, muitos aspectos fascinantes da biologia vespa permanecem obscuros. Estes incluem questões relacionadas com a gama de hospedeiros, imunossupressão, superparasitismo e comportamento. O foco desta apresentação foi demonstrar os efeitos da infecção nos tecidos imunes a mosca. As técnicas de dis...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materiais	Tipo	Companhia	Número de Catálogo
Materiais para manutenção da cultura de insetos
Levedura	Seca ativa	Fisher Scientific	S802453
Fly alimentos	O fubá de milho, açúcar		Receita padrão
Mel	Trevo	Holandês Ouro
Frascos	Frascos de polipropileno (estreito)	Fisher Scientific	AS514
Fechamento dos frascos	Tampão de algodão	Fisher Scientific	AS212
Fechamento dos frascos	Zumbido ficha	Genesee Científico	AS273
Incubadora refrigerada	Precision 815	Thermo Scientific	3721
Materiais para a preparação da amostra
CO tanque 2	Grau seco osso	TW Smith	UN1013
Espátula	Espátula Micro (14 cm)	Fisher Scientific	21-401-15
Teste Pyrex placas local	9-bem dissecar placa de 85 mm x 100 mm	Thomas Scientific	7812G17
Pipetas Pasteur	Cal de soda	J & H Berge	71-5200-05
Fórceps	Estilo # 5	Sigma	T-4662
Etanol	190 USP prova	Fisher Scientific	04-355-221
Formaldeído	37% w / w	Fisher Scientific	F79-1
Anticorpo secundário Cy3 AffiniPure de burro anti-coelho IgG (H + L)	1:50 excitação de 546 nm, 565 nm de emissão	Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.	711-165-152
Antifade (N-propil-galato)	4 ug / ml em glicerol a 50% em PBS 1X	Biomedicals MP	10274790
Glicerina		Fisher Scientific	G33-1
Hoechst 33258	0,2 ug / ml de excitação 352 nm, emissão 461 nm	Molecular Probes	H-1398
Rodamina faloidina	200 unidades / ml (6,6iM de excitação) 540 nm, emissão 565 nm	Molecular Probes	R415
Alexa Fluor 488 faloidina	300 unidades / ml de excitação de 495 nm, emissão 518 nm	Molecular Probes	A12379
Descartáveis
Esguicho	Fisherbrand	Fisher Scientific	03-409-22A
Kimwipes	Kimberly Clark	Fisher Scientific	06-666A
Toalha de papel	1 ply C-Fold	Franzir	901-7CFTB2400
Microscopia
Estereomicroscópio Leica	MZFLIII	Império Imaging Systems, Inc.	10446208
Stereomicroscope Zeiss	Stemi 1000 ou 2000-C	Carl Zeiss	000000-1006-126
Fonte de Luz - LED	Iluminador Gooseneck	Fisher Scientific	12563501
Etapa	Transmitido caixa de luz com placa	Carl Zeiss	455137000
Zeiss de varredura a laser microscópio confocal	LSM 510	Carl Zeiss
Microscópio Zeiss composto	Axioplan 2 na posição vertical	Carl Zeiss

Cepas de vespas	Fly Estirpes
Leptopilina victoriae 16	yw
Leptopilina boulardi 17 1	UAS-GFP Dorsal-17
Leptopilina heterotoma 2	SerpentHemoGal4 13
Leptopilina heterotoma 14 1	MSNF9-moCherry 14
Trichopria drosófilas	MSNF-GFP 15
Ganaspis xanthopoda 18	yw Serpente Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc 4
	yw; Drosomycin-GFP/CyO y + 12