Protocolos para inoculação vaginal e coleta de amostra no Modelo Experimental de Rato Candida Vaginite

Resumo

Principais técnicas a serem utilizados na avaliação de Candida Vaginite em um modelo animal experimental são descritos. Os métodos permite uma recolha rápida de amostras vaginais e linfócitos de linfonodos drenantes lombar. Estas técnicas podem dar origem a modelos de ratos de outras doenças na parte inferior do trato genital feminino.

Resumo

Vulvovaginal candidíase (VVC), causada por espécies de Candida, é uma infecção fúngica do trato genital feminino, que afeta aproximadamente 75% das mulheres saudáveis ​​durante seus anos reprodutivos ^18,32-34. Os fatores predisponentes incluem uso de antibióticos, diabetes descontrolado e perturbação nos níveis de hormônios reprodutivos devido à gravidez, contraceptivos orais ou terapias de reposição hormonal ^33,34. VVC recorrente (RVVC), definida como três ou mais episódios por ano, afeta a 5 separada a 8% das mulheres sem fatores predisponentes ^33.

Um modelo experimental de rato VVC foi estabelecida e utilizado para estudar a patogênese e resposta do hospedeiro mucosa a Candida ^{3,4,11,16,17,19,21,25,37.} Este modelo também foi empregado para testar potenciais terapias antifúngicas in vivo ^13,24. O modelo exige que os animais sejam mantidos em estado de pseudoestrus para optimal Candida colonização / infecção ^6,14,23. Sob tais condições, animais inoculados terá carga fúngica vaginal detectável por semanas a meses. Estudos anteriores mostram um paralelo extremamente elevada entre o modelo animal e infecção humana em relação a propriedades imunológicas e fisiológicas ^3,16,21. Diferenças, entretanto, incluem a falta de Candida como flora vaginal normal e um pH neutro vaginal nos ratos.

Aqui, nós demonstramos uma série de métodos-chave no modelo de mouse que vaginite incluem inoculação vaginal, rápida coleta de amostras vaginal, avaliação da carga fúngica vaginal, e as preparações para a extração do tecido celular / isolamento. Isto é seguido por resultados representativos para constituintes do lavado vaginal, carga fúngica, e drenagem linfática produz leucócitos nó. Com o uso de anestésicos, as amostras de lavagem podem ser coletados em momentos diversos na mesma camundongos para avaliação longitudinal dainfecção / colonização. Além disso, este modelo não necessita de agentes imunossupressores para iniciar a infecção, permitindo estudos imunológicos em condições host definido. Finalmente, o modelo e cada técnica introduzida aqui poderia potencialmente dar origem a utilização das metodologias para examinar outras doenças infecciosas do trato genital feminino (bacterianas, parasitárias, virais) e respectivas defesas do hospedeiro local ou sistêmica.

Protocolo

1. Inoculação vaginal com Candida albicans

1. Três dias antes da inoculação, enquanto prender o animal para expor o abdomen, injetar 100 ml de óleo de gergelim contendo 0,1-0,5 mg de β-estradiol por via subcutânea na parte inferior do abdômen. Antecedência a agulha cerca de 5 a 10 mm lateral à pele para minimizar a perda no local da injeção.
   A administração subcutânea de estrogênio no abdômen inferior é ideal neste modelo devido à proximidade com o trato genital. Doses eficazes podem variar de acordo com linhagens de camundongos, idades ou derivados de estrógeno. Em estudos anteriores usando CBA-J (H-2 ^κ), C3H/HeN (H-2

Discussão

Um modelo experimental do rato de Candida vaginite foi estabelecida e usada historicamente para as últimas décadas para estudar a resposta do hospedeiro mucosa a Candida, bem como para testar terapias antifúngicas ^{3,4,11,13,16,17,19,21,24, 25,37.} Os protocolos aqui apresentados incorporam métodos eficientes e menos trabalhoso, e parecem ser um dos sistemas de modelo mais otimizada de Candida vaginite descritas até o momento. Estas técnicas permitem a quantificação rápida da carga fú.......

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Feminino camundongos CBA / J	Charles River Laboratories	01C38	5-6 semanas de idade
Candida albicans (3153A)	Colecção Nacional de fungos patogênicos, UK	NCPF3153
Óleo de gergelim	Sigma-Aldrich	S3547	Não precisa ser pré-esterilizadas antes do uso
Β-estradiol 17-valerato	Sigma-Aldrich	E1631	0.1-0.5mg em óleo de gergelim
Phytone peptona	Becton Dickinson	211906	Suplemento com glicose 0,1%
Solução de azul de Trypan	Sigma-Aldrich	T8154
Ágar Sabouraud dextrose	Becton Dickinson	211584
Colagenase tipo IV	Sigma-Aldrich	C5138	0,25%
Dispase	Invitrogen	17105-041	1,7 U / ml
Malha de telas de arame	TWP	060X060S0065W36T	No. 60 mesh, aço inoxidável
Solução de Hanks salina balanceada	Invitrogen	24020-117
CytoPrep fixador	Fisher Scientific	12-570-10	Preserva esfregaço
Papanicolaou mancha EA-65	Merck Química	7054X-85
Papanicolaou mancha OG-6	Merck Química	7052X-85
Hematoxilina de Harris Alum	Merck Química	638A-85
Isoflurano	Baxter Healthcare	NDC 10019-773-60	Usado com vaporizador de isoflurano ou em um sistema fechado queda anestésico câmara