Summary
Plasmoniska pincett och fotoniska nanostrukturer kristaller visas att producera användbara förbättringar i effektivitet och orientering kontroll av optiskt fånga mikro-och nano-partiklar.
Abstract
En metod för att manipulera position och orientering submicron partiklar icke-förstörande skulle vara ett otroligt användbart verktyg för grundläggande biologisk forskning. Kanske den mest använda fysiskt våld för att uppnå icke-invasiv manipulation av små partiklar har dielectrophoresis (DEP). 1 saknar dock DEP på egen hand den mångsidighet och precision som önskas när manipulera celler eftersom det traditionellt gjort med stationära elektroder. Optisk pincett, som utnyttjar en tredimensionell lutning elektromagnetiska fält för att utöva krafter på små partiklar, uppnå detta önskade mångsidighet och precision. 2 är dock en stor nackdel med denna metod den höga strålningen intensitet som krävs för att uppnå den nödvändiga kraft för att fälla en partikel som kan skada biologiska prov 3 En lösning som gör att fångst och sortering med lägre optisk intensitet är optoelektronisk pincett (OET) men OET s har begränsningar med fina manipulation av små partiklar,.. är DEP-baserad teknik också lägger hinder för egendom av lösningen 4 , 5
Denna video artikeln kommer att beskriva två metoder som minskar intensiteten av den strålning som behövs för optisk manipulation av levande celler och även beskriva en metod för orientering kontroll. Den första metoden är plasmoniska pincett som använder en slumpmässig guld nanopartiklar (AuNP) array som ett substrat för provet som visas i figur 1. Den AuNP array omvandlar incidenten fotoner till lokaliserade ytan plasmoner (LSP) som består av resonanta dipolmoment som utstrålar och genererar en mönstrad strålfält med en stor lutning i cellen lösningen. Inledande arbete på ytan plasmon ökad fångst av Righini et al och våra egna modeller har visat fält som genereras av plasmoniska substrat minskar den initiala intensiteten som krävs genom att öka lutningen fält som fällor partikeln. 6,7,8 Den plasmoniska tillvägagångssätt gör det möjligt för fina orientering kontroll över ellipsoidisk partiklar och celler med låg optisk intensitet på grund av effektivare optiska energin omvandlas till mekanisk energi och en dipol beroende strålfältet. Dessa fält visas i figur 2 och den låga fångsten intensitet beskrivs i siffror 4 och 5. De största problemen med plasmoniska pincett är att LSP är generera en betydande mängd värme och fångsten är bara tvådimensionell. Denna värme genererar konvektiva flöden och thermophoresis som kan vara tillräckligt kraftfull för att driva ut submicron partiklar från fällan. 9,10 Den andra metoden som vi kommer att beskriva är att utnyttja periodisk dielektrisk nanostrukturer att sprida infallande ljus mycket effektivt i diffraktion lägen, som visas i figur 6 11. Helst skulle man göra denna struktur ur ett dielektriskt material för att undvika samma värme problem med plasmoniska pincett, men i vårt förhållningssätt en aluminium-belagd diffraktionsgitter används som en endimensionell periodisk dielektrisk nanostruktur. Även om det inte är en halvledare, gjorde det upplever inte signifikant uppvärmning och effektivt fångade små partiklar med låg fånga intensitet, som visas i figur 7. Anpassningen av partiklar med gallret substrat validerar begreppsmässigt påståendet att en 2-D fotoniska kristaller kan ge exakt rotation av icke-sfäriska micron stora partiklar. 10 Effektivitetsvinsterna av dessa optiska fällor är ökade på grund av den förbättrade fält som produceras av nanostrukturer som beskrivs i detta dokument.
Protocol
1. Slumpmässiga Au nanopartiklar Array Fabrication 8,10,12,14
- Au nanopartiklar arrayen bildas genom att först skapa en mall som är gjord av ett tätt skikt av slumpmässigt adsorberat latex kulor med en genomsnittlig diameter på 454 nm. Detta uppnås genom att först avdunsta guld på ett glas täckglas till en tjocklek på 20 nm med krom som vidhäftning lager.
- Den polystyren sfären cellslager är sedan själv ihop genom att exponera det guld-belagda substrat för en blandning av 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl) carbodiimide hydroklorid (EDC), latex sfären fjädring och avjoniserat vatten.
- Adsorptionen process får pågå i ungefär en timme och den icke-absorberade sfärer spolas bort med mycket vatten.
- Den bildade cellslager får lufttorka.
- Slutligen är ytterligare 20 nm guld avdunstat på latex sfären cellslager att bilda slumpmässiga samling guld nanopartiklar.
- Om ett SEM är tillgänglig kan den AuNP rad ses inom ramen för SEM att se ut som Figur 1 och ett diagram över processen visas i figur 8.
2. Biologiska Provberedning 9,11
- Provberedning för optiskt fånga musen cellkärnor visas nu.
- 3T3 Mus cellkärnan taggade med akridinorange färg erhölls från Tewari gruppen vid Fred Hutchinson Cancer Research Center.
- 10% bovint serumalbumin (BSA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) läggs till musen cellkärnorna i en koncentration av ca 1: 10 (BSA: Mus cellkärnor). BSA bidrar till att förhindra kärnor fastnar på underlaget.
- Blanda lösning med sonication.
- 5 ul av vår lösning är deponeras på aluminium galler array täckglas. Det är bättre att utföra detta steg med aluminium galler på mikroskop scenen så att du inte behöver transportera provet efter det att lösningen har deponerats.
- Två buntar med två 1 "av en" täckglas används till att stödja 1 / 5 täckglas genom vilket provet ses.
- Placera provet i mikroskop för visning.
3. Metod för att fånga
- Den optiska pincetten är konstruerade genom att skicka en 35 mW helium-neon laser genom en Zeiss Axio Imager.D1M utrustad med en GFP 17 filter som som är modifierad för att tillåta 633 nm laserstrålning att nå provet.
- En Zeiss LD EG Epiplan - NEOFLUAR 50x objektiv används för att bilden av cellkärnorna som är ca 5 mikrometer i diameter.
- Efter provet placeras under mål, fokusera mikroskopet på guld nanopartiklar matris eller diffraktionsgitter.
- Översätt mikroskop vertikalt tills skärpan är på kärnorna som du önskar att fälla.
- Placera lasern fälla plats över partikel och partikeln bör då behålla sin position i laserpunkt även när scenen är översatt.
4. Representativa resultat:
Den slumpmässiga guld nanopartiklar rad förfaranden bör deponera ett monolager av AuNP det är kan ses i ett SEM att se ut som Figur 1. Fångsten kraft som skapas av dessa plasmoniska pincett kan 10-20 gånger den kraft som genereras av vanlig optisk pincett. Den lägsta intensitet som krävs av plasmoniska pincett för att uppnå partikel inneslutning visas för partiklar av olika storlek i Figur 4. 9,10 Diffraktionsgittret uppnås anpassning och fångst med 20 gånger högre fånga effektivitet än guldet nanodots och kunde uppnå fånga med så liten som 17 uw / um 2 (Figur 7). 11
Figur 1 10 (a) SEM av egna sammansatta guld nanopartiklar. Diametern på individuella guld nanopartiklar är ca 450 nm. (B) NSOM bild av plasmoniska substrat där nanopartiklar distributionen är gles, visar närområdet strålning. Den våglängd excitation laser är 633 nm. (C) Hög förstoring bild av området märkt med den röda kvadraten i (b). (D) Scattering effektiviteten spektrum plasmoniska substratet, visar topp på 624 nm. (E) absorptionseffektivitet spektrum plasmoniska substratet, visar topp på 668 nm.
Figur 2 13 (a) Au nanospheres slumpmässigt fördelade på ett 2D-domän 1 x 1 mm 2. Varje blå prick representerar mitten av NanoSphere (a = 60 nm). Scattering fältet distributioner på observation plan som är parallella med slumpmässiga NanoSphere samling visas i (b) - (e). Den NanoSphere array är jämnt upplyst av en plan våg vid våglängden 540 nm. Brytningsindex för omgivande medium är 1,33. Den Polarization riktning pekar plan våg längs X-axeln (horisontell i (a)). Omfattningen av händelsen elektriska fältet antas vara 1 i beräkningen. Separationen mellan observation planet och NanoSphere arrayen är definierad som h. b) h = en. c) h = 2a. d) h = λ. e) h = 2λ.
Figur 3 9 Schematisk av kundanpassade fluorescensmikroskop konfiguration inklusive en förbi excitation filter och en utbytt dikroiska balk-splitter. Detta är den konfiguration som används för samtidig fånga och fluorescens avbildning.
Figur 4 10 Den minsta laser intensitet för att bibehålla den fälla som funktion av flödet av omgivande vätska utnyttja plasmoniska svällning. Alla optiska intensiteter värderas till provet planet under mikroskop målet. (A) - (f) visar mätresultaten för ensamstående polystyren kulor med diameter 7,3, 6,3 (icke-sfäriska), 5,0, 3,9, 2,5 och 1,1 ìm, respektive. Den inläggningar visar motsvarande mikroskopiska bilder av partiklar. Skalan barer i alla bilder som representerar 5 mikrometer i längd.
Figur 5 10 Lutningen av den anpassade linjen genom ursprung i bild. 4 kontra partikelstorlek för plasmoniska svällning. Felet Staplarna visar standardavvikelserna för den linjära passar. Lutningen av den anpassade linjen (förhållandet mellan den optiska intensiteten tröskeln och flöde) i bild. 4 har ungefär linjärt förhållande med partikelstorlek som visas i denna figur, som visar fördelen med plasmoniska fånga speciellt för mindre partiklar.
Figur 6 11 (a) Schematisk bild av förbättrad optisk fånga använder 1-D periodiska nanostrukturer. Den infallande strålen är brytas av periodiska nanostruktur vid Far Field. (B) Intensiteten ljusfördelning med två ortogonala statens kulturråd nanostruktur vid Far Field. (B) Intensiteten ljusfördelning med två ortogonala statens kulturråd på ytan av en aluminium galler med en 417 nm period erhålls med FDTD simuleringar. Fördelningen är normaliserat till intensiteten på en plan aluminium yta. (C) och (d) Fångst potential för partiklar direkt ovanför gallret yta kontra placeringen av partikeln för (c) en 350 nm polystyren pärla och (d) en 1 mm polystyren pärla. De vita cirklarna visar storleken på de partiklar. Inläggningar visa fånga potentiella ovanför en plan aluminiumyta för samma partikelstorlek som jämförelser. Värdena är normaliserade för varje partikelstorlek. För alla FDTD simulering siffror synfältet är 10 x 8 ìm 2.
Figur 7 11 (a) Trap effektivitet och minimal svällning intensitet mätt för polystyren pärlor i olika storlekar med bredd polarisering vinkelrätt mot gallret linjer. Infällda bilden visar fällan asymmetri i svällning effektivitet för att översätta en 3,87 um polystyren pärla vinkelrätt och parallellt med reglerna i gallret. Den heldragna linjen (stor asymmetri) erhålls med infallande ljuset polariserat vinkelrätt mot gallret och streckad linje (liten asymmetri) erhålls med infallande ljuset polariserat parallellt med gallret. Enheten är i (PN [mW / ìm 2] -1). (B) - (d) Fångst demonstration av ett fluorescerande 590 nm polystyren pärla. Den röda cirkeln anger position laserpunkt som laserljuset var för svag att se. Vid första partikeln är instängd inom platsen vid högre effekt, eftersom strömmen är sänkte Brownsk rörelse av partiklar övervinner fångst kraft, vilket gör att partikeln att fly. (E) - (g) Fångst demonstration av ett fluorescerande äggstockscancer cellkärna. Den minsta intensitet som krävs för att inleda fångst var 16 μW / ìm 2 erhålls genom ett 20x objektiv.
Figur 8 14 Tillverkning förfarande av den gemensamma jordbrukspolitiken-formade guld nanopartiklar: a) avdunstning av Cr och Au tunt skikt på glaset täckglas. b) Exponering av polystyren sfären fjädring och adsorption av sfärer i 1 timme. c) undanröjande av icke-adsorberat polystyren kulor och torkning av ytan. d) Avdunstning av ytterligare ett lager av Au ovanpå mallen sfärer. e) Schematisk av cap-formade Au nanopartiklar array, där Au bara täcker ovansidan av mallen sfärer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydelsen av dessa fångstmetoder är att de minskar den optiska intensiteten nödvändiga för en hållbar fångst från någonstans i storleksordningen 10 3 μW / ìm 2 till någonstans i storleksordningen 10 μW / ìm 2. 10,11 Begränsningarna för dessa tekniker är att guldet nanopartiklar rad upplevelser värme problem som måste övervinnas. För att lösa detta problem kan en 2D fotoniska kristaller struktur som består av ett dielektriskt material användas. En sådan struktur kan teoretiskt producera svällning vid låg optisk intensitet och kontroll mikro-och nano-partiklar rotation och position i ett precist sätt genom att styra in polarisering. Gallret ger figurerna 6 och 7 visar att detta stämmer för 1D fallet. Nästa steg skulle vara att skapa en 2D fotoniska kristaller och visa en fotoniska kristaller pincett array som skulle underlätta många biologiska forskningsansökningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill också tacka Xiaoyu Miao och Ben Wilson för att utveckla de flesta av de metoder som beskrivs inom. Detta arbete har finansierats av National Science Foundation (DBI 0.454.324) och National Institute of Health (K21 EB005183) och PHS NRSA T32 GM07270 från NIGMS till Eck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Company | Catalog Number | Comment |
| Axio Imager Microscope (D1M) | Carl Zeiss, Inc. | D1M | Zeiss Axio Imager.D1M |
| Microscope Objective (50x/0.55) | Carl Zeiss, Inc. | LD EC Epiplan - NEOFLUAR 50x/0.55 HD DIC | |
| Zeiss Microscope Camera (AxioCam MRc) | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Helium Neon Laser (35 mW) | Research Electro-Optics | ||
| Continuously Variable Attenuator | Thorlabs Inc. | NDC-100C-4M | For adjusting microscope intensity |
| Zeiss Filter Set #17 | Carl Zeiss, Inc. | 488017-9901-000 | Filter Set #17 |
| Microscope Slides, 0.5 mm thickness | VWR international | ||
| 3T3 mouse cell nuclei | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Store as cold as possible | |
| Acridine Orange dye | Fred Hutchinson Cancer Research Center | ||
| Bovine Serum Albumin, 1 to 10 ration in PBS | Fred Hutchinson Cancer Research Center | ||
| 454 nm polystyrene latex spheres | Polysciences, Inc. | ||
| carbodiimide hydrochloride (EDC) - 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) | G-Biosciences | BC25-1 | |
| gold (for deposition) | |||
| Reflective ruled diffraction grating | Edmund Scientific | ||
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) | Invitrogen | 14190-144 |
References
- Jones, T. B. Electromechanics of Particles. , Cambridge University Press. (1995).
- Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4853-4853 (1997).
- Neuman, K. C., Chadd, E. H., Liou, G. F., Bergman, K., Block, S. M. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophys. J. 77, 2856-2856 (1999).
- Chiou, P. C., Ohta, A. T., Wu, M. C. Massively parallel manipulation of single cells and microparticles using optical images. Nature. 436, 370-370 (2005).
- Hsu, H. Y., Ohta, A. T., Chiou, P. Y., Jamshidi, A., Nealea, S. L., Wua, M. C. Phototransistor-based optoelectronic tweezers for dynamic cell manipulation in cell culture media. Lab Chip. 10, 165-172 (2010).
- Righini, M., Ghenuche, P. S., Cherukulappurath, V., Myroshnychenko, F. J., Garcia de Abajo, R. Quidant Nano-optical Trapping of Rayleigh Particles Escherichia coli Bacteria with Resonant Optical Antennas. Nano Letters. 9, 3387-3391 (2009).
- Righini, M., Zelenina, A. S., Girard, C., Quidant, R. Parallel and Selective Trapping in a Patterned Plasmonic Landscape. Nature Physics. 3, 477-480 (2007).
- Miao, X., Lin, L. Y. Large dielectrophoresis force and torque induced by localized surface plasmon resonance of a cap-shaped Au nanoparticle array. Opt. Lett. 32, 295-297 (2007).
- Wilson, B. K. Manipulation of Nanoparticles and Biological Samples through Enhanced Optical Forces [dissertation]. , University of Washington, Seattle. (2009).
- Miao, X. Y., Wilson, B. K., Pun, S. H., Lin, L. Y. Optical manipulation of micron/submicron sized particles and biomolecules through plasmonics. Optics Exp. 16, 13517-13525 (2008).
- Wilson, B. K., Mentele, T., Bachar, S., Knouf, E., Bendoraite, A., Tewari, M., Pun, S. H., Lin, L. Y. Nanostructure-enhanced laser tweezers for efficient trapping and alignment of particles. Optics. Exp. 18, 16005-16013 (2010).
- Miao, X., Wilson, B. K., Cao, G., Pun, S. H., Lin, L. Y. Trapping and Rotation of Nanowires Assisted by Surface Plasmons. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 15, 1515-1520 (2009).
- Miao, X. Y., Lin, L. Y. Trapping and manipulation of biological particles through a plasmonic platform. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 13, 1655-1662 (2007).
- Miao, X. Plasmonics for Micro/Nano Manipulation and Optofluidics [dissertation]. , University of Washington, Seattle. (2008).
