O sistema de genética reversa para o vírus da febre Rift Vale cepa vacinal MP-12 é uma ferramenta útil para a criação de adicionais MP-12 mutantes com atenuação aumentada e imunogenicidade. Nós descrevemos o protocolo para gerar e caracterizar NSS cepas mutantes.
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Artigo de método
Usando genética reversa para manipular o NSS Gene do vírus da febre Rift Valley MP-12 Strain para melhorar a segurança e eficácia da vacina
Neste artigo
Resumo
Resumo
Vírus da febre Rift Valley (RVFV), que causa febre hemorrágica, distúrbios neurológicos ou cegueira em humanos, e uma alta taxa de aborto e malformação fetal em ruminantes 1, foi classificado como um HHS / USDA sobreposição agente selecionado e um grupo de risco 3 patógeno. Pertence à Phlebovírus gênero no Bunyaviridae família e é um dos membros mais virulenta dessa família. Vários sistemas de genética reversa para a cepa vacinal MP-12 RVFV 2,3, bem como cepas do tipo selvagem RVFV 4-6, incluindo ZH548 e ZH501, têm sido desenvolvidos desde 2006. O MP-12 estirpe (que é um grupo de risco 2 patógeno e um agente não-select) é altamente atenuada por várias mutações em seu M e L-segmentos, mas ainda carrega virulenta segmento S-RNA 3, que codifica uma virulência funcional NSS fator. O rMP12-C13type (C13type) transportando 69% em-frame de eliminação do NSS ORF não tem todas as funções NSS conhecida, enquanto ele replica como effictário como faz MP-12 em células VeroE6 faltando tipo I IFN. NSS induz um shut-off de transcrição de hospedeiros, incluindo interferon (IFN)-beta mRNA 7,8 e promove a degradação de double-stranded RNA-proteína quinase dependente (PKR) em nível de pós-translacionais. 9,10 IFN-beta é transcricionalmente upregulated por interferon fator de regulação 3 (IRF-3), NF-kB e proteína ativadora-1 (AP-1), ea ligação do IFN-beta para IFN-alpha/beta receptor (IFNAR) estimula a transcrição de IFN-alpha genes ou de outros genes interferon estimulada (ISGs) 11, que induz actividades de acolhimento antiviral, ao passo que a supressão anfitrião de transcrição incluindo IFN-beta gene pela NSS impede que o gene upregulations daqueles ISGs em resposta a replicação viral, embora IRF-3, NF-kB e ativador proteína-1 (AP-1) pode ser ativado por RVFV7. . Assim, o NSS é um excelente alvo para continuar a atenuar MP-12, e para melhorar a resposta imune inata anfitrião, abolindo a função de supressão de IFN-beta. Aqui, Nós descrevemos um protocolo para a geração de um recombinante MP-12 NSS codificação mutado, e fornecer um exemplo de um método de triagem para identificar mutantes NSS falta a função de suprimir a síntese de IFN-beta mRNA. Além de seu papel essencial na imunidade inata, tipo I IFN é importante para a maturação das células dendríticas e indução de uma resposta imune adaptativa 12-14. Assim, os mutantes NSS induzindo tipo I IFN são mais atenuadas, mas ao mesmo tempo, são mais eficientes na resposta do hospedeiro estimulante imunológico do tipo selvagem MP-12, o que os torna candidatos ideais para abordagens de vacinação.
Protocolo
1. Recuperação de recombinantes mutação NSS MP-12 codificação (s) de DNAs plasmídeo 2
- Spread rim de hamster bebé (BHK) / T7-9 células 15, que expressa estavelmente T7 RNA polimerase, em 6 cm de pratos em Meio Essencial Mínimo (MEM)-alfa (Invitrogen, Cat # 32561037) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS ), penicilina-estreptomicina (Penicilina: 100 U / ml Estreptomicina: 100 mcg / ml) (Invitrogen, Cat # 15140122), e 600 mg / ml de higromicina B (Cellgro, Cat # 30-240-CR).
* A eficiência de recuperação viral é mais elevada em 6 cm-pratos do que em 35 mm-pratos. BHK/T7-9 células com baixo nível de passagem de suportar taxas mais al....
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Discussão
Genética reversa de sistemas para RVFV foram desenvolvidos por vários grupos, utilizando T7 promoter 2,4,5 ou mouse de 3 ou 4 humanos promotor pol-I. Neste manuscrito, nós descrevemos um protocolo para gerar recombinantes RVFV MP-12 linhagens de células usando BHK/T7-9 15 que expressa estavelmente T7 RNA polimerase. A eficiência de recuperação viral variava de acordo com a condição de BHK/T7-9 células, a quantidade de plasmídeos, o número de células transfectadas e assim por d.......
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Divulgações
Não temos nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Grant Number 5 U54 AI057156-07 através do Centro Regional de Excelência Ocidental (WRCE), um R01 AI08764301-A1 do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, e um financiamento interno do Sealy Center for Vaccine Development da Universidade de Texas Medical Branch.
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Materiais
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comments (opcional) |
| Meio Essencial Mínimo (MEM)-alfa | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco modificado de médio mínimo essencial | Invitrogen | 11965092 | |
| Modificado Águia Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicilina-estreptomicina | Invitrogen | 15140122 | |
| Higromicina B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Triptose fosfato de caldo | Biomedicals MP | 1682149 | |
| Ágar Noble | VWR | 101170-362 | |
| Trânsito LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Tampa apertada Aerosol | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0,33% solução de vermelho neutro | Sigma Aldrich | N2889-100ML | |
| Células C57/WT MEF | InvivoGen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | InvivoGen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-QB1 | |
| BHK/T7-9 células 15 | Gifu University, Japão | ||
| Células Vero E6 | ATCC | CRL-1586 |
Referências
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, an....
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Reimpressões e permissões
