Monitoramento de Atividades de caspase-3 Clivadas e apoptose das células oligodendrogliais Imortalizado usando Live-célula Imaging and Cleaveable Fluorogênico-dye seguintes substratos de potássio induzida por despolarização da membrana

Resumo

Live-célula de imagem de caspase-3 apoptose mediada em imortalizado culturas N19-oligodendrócitos célula usando o NucView Caspase-3 488 substrato. Esta técnica é aplicável para ensaios de morte celular programada em tempo real em uma variedade de tipos de células e tecidos.

Resumo

O sistema nervoso central podem experimentar uma série de tensões e traumas neurológicos, que podem ter vários efeitos adversos que acabará por levar a uma redução da população neuronal e função. Axônios danificado pode liberar moléculas excitatório glutamato, incluindo potássio, ou na matriz extracelular, que por sua vez, pode produzir mais insulto e prejuízo para as células da glia de apoio, incluindo astrócitos e oligodendrócitos ^{8, 16.} Se o insulto persistir, as células sofrem morte celular programada (apoptose), que é regulado e ativado por um número de bem estabelecida cascatas de transdução de sinal ^14. Apoptose e necrose do tecido pode ocorrer após lesão cerebral traumática, isquemia cerebral e convulsões. Um exemplo clássico de regulação por apoptose é a família de cisteína-dependente aspartato-proteases dirigidas, ou caspases. Proteases ativadas, incluindo caspases também têm sido implicados na morte celular em resposta a neuro crônicadoenças degenerativas incluindo Alzheimer, Huntington, esclerose múltipla e ^{4, 14, 3, 11, 7.}

Neste protocolo, descrevemos o uso do 488 NucView substrato caspase-3 para medir a taxa de apoptose caspase-3 mediada em imortalizado N19-oligodendrócitos culturas (OLG) celular ^{15, 5,} após a exposição a diferentes tensões extracelular, tais como altas concentrações de potássio ou glutamato. A linhagem celular imortalizada condicionalmente-N19-OLG (representando o progenitor O2A) foi obtido de Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) ^{15, 5,} e tem sido utilizado anteriormente para estudar os mecanismos moleculares de mielina expressão gênica e transdução de sinal de liderança OLG a diferenciação (por exemplo, ^{6, 10).} Nós encontramos essa linha de células para ser robusto com respeito a transfecção com exógenos proteína básica de mielina (MBP) constrói soldados a qualquer RFP ou GFP (vermelho ou verde proteína fluorescente) ^13,12. Aqui, as culturas celulares N19-OLG foram tratados com cloreto de potássio 80 mM glutamato de sódio ou 100 mM para imitar vazamento axonal na matriz extracelular para induzir a apoptose ^9. Usamos um bi-funcionais substrato caspase-3 contendo uma DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 subunidade reconhecimento e um corante DNA-binding ^2. O substrato rapidamente entra no citoplasma onde é clivado pela intracelular caspase-3. O corante, NucView 488 é liberado e entra no núcleo da célula onde se liga DNA e fluoresce verde a 488 nm, sinalizando apoptose. Uso do 488 caspase-3 NucView substrato permite viver de células de imagem em tempo real ^{1, 10.} Neste vídeo, nós também descrever a cultura e transfecção de células imortalizadas N19-OLG, bem como técnicas de live-célula de imagem.

Protocolo

1. Descongelamento e cultura de células

1. Obtenção de estoque de congelados imortalizado N19-oligodendroglial células do tempo de armazenamento de nitrogênio líquido termo.
2. Frasco contendo células mergulhar a 37 ° C banho-maria até que a suspensão celular é completamente descongelado.
3. Adicionar 7 ml de DMEM (Dulbecco Modificado de Médio Eagle) com glicose alta suplementado com 10% FBS (soro fetal bovino) e 1% de penicilina / estreptomicina a uma placa de cultura de 10 cm.
4. Adicione o celular suspensão gota a gota, à placa, e agite suavemente e rock a placa de Petri para dispersar as células uniformemente.
5. Células de cultura a 34 ° C / 5% da incubadora de CO _2.
6. Após 4 horas, media aspirado de placas para remover qualquer DMSO restante (dimetilsulfóxido), que tinha sido usado como crioprotetor, e substituir por novas mídias (7 mL DMEM alta glicose meio suplementado com 10% de SFB e 1% de penicilina / estreptomicina) .

2. Células Passaging

1. Em 70-80%confluência (4-7 dias de crescimento), aspirado de mídia a partir de células.
2. Adicionar 1 mL de tripsina 0,25% ao prato. Pipeta de tripsina para separar células (cerca de 5 minutos).
3. Faça as diluições apropriadas para as condições experimentais e passagem de uma placa adicional de 10 centímetros para futuros experimentos com uma densidade de células não menos que 0,1 x 10 ⁶ células / ml.

Nota: Você deve passar suas células pelo menos duas vezes após o descongelamento antes de usá-los para experiências.

3. Contagem e cultivo de células

1. Às células placa de live-célula de imagem, trypsinize como descrito anteriormente.
2. Remover cerca de 30 mL de células e contagem usando um hemocitómetro.
3. Coloque uma lamela de vidro sem revestimento em uma placa de 6 bem. Adicionar células para o bem, a uma densidade de 0,1 x 10 ⁶ células / mL em 2 mL de fenol livre de DMEM alta glicose mídia, suplementado com 10% de SFB e 1% de penicilina / estreptomicina, em 34 ° C / 5% CO _2.
4. Permitircélulas a crescer durante a noite (16-20 h) em 34 ° C / 5% CO ₂ antes de transfecção.

4. Transfecção

1. Combine 100 L de soro de mídia livre, 0,5-4 mg DNA plasmidial purificado e 4 mL FuGENE HD (Roche). Vortex cuidadosamente para misturar.
2. Vortex novo brevemente e permitir que o DNA ao complexo por 5 min à temperatura ambiente, e depois adicionar FuGENE mistura DNA HD diretamente para as células em cultura. Incline a placa delicadamente para misturar.
3. Cultura as células para um adicional de 48 h em 34 ° C / 5% CO ₂ antes do tratamento ou experimentação.

5. Células preparando para o Live-Cell Imaging (LCI)

1. Ligue o Chamlide LCI caixa de controle ao vivo de células instrumento, pelo menos, 1 h antes que você queira iniciar o seu experimento. A caixa de controle também regula a temperatura ea umidade dentro do Chamlide LCI, e regula o fluxo do pré-misturados 5% CO _2.

Nota: É aconselhávelligar a caixa de controle até 3 h antes dos experimentos início para garantir que todo o palco atinge 34 ° C. Esta etapa irá reduzir a deriva focal, que é causada por fluxulation e expansão térmica da fase de metal como se aquece, durante o exame.

2. Trabalhando em um fluxo-capa, spray na câmara de cultura Chamlide magnético do tipo, e uma pinça, com etanol 70% e deixe secar por 5 minutos.
3. Remover as células da incubadora e confirmar que eles são saudáveis. Eles devem aparecer aderente e bem espalhado sobre a lamínula de vidro com processos de membrana numerosos. Células que estão estressados ​​de transfecção não são adequados para a experimentação, e terá um número reduzido de extensões de processos, e muitas vezes têm um núcleo de formato irregular.
4. Incline a placa 6-bem e retire a lamela com pinça. Rapidamente coloque o lado célula lamínula para cima no tabuleiro inferior da câmara de cultura. Não permita que a lamela para secar.
5. Anexar o magnético principalcorpo da câmara de cultura e adicionar 500 mL de mídia a partir da placa 6-bem original para o topo da lamela. Re-utilizar esta mídia vai diminuir a quantidade de estresse colocado sobre as células causados ​​por mudanças ambientais, e também pode ser útil para avaliar extracelular fatores secretados.
6. Coloque a tampa de vidro na câmara de cultura.
7. Use uma KimWipe pulverizadas com etanol 70% para remover qualquer material residual do fundo da lamela, o que interfere com a microscopia.
8. Coloque a câmara de cultura nos 34 ° C / 5% incubadora de CO ₂ por 30 min. Esta etapa irá assegurar que a câmara se aquece a 34 ° C para reduzir o deslocamento da lamínula como o metal se aquece.

6. Configurações de microscópio

Imagens foram adquiridas aqui, usando um microscópio Leica DMIRE2 invertido com uma lente relay personalizado e habitação de emissão roda de filtros de cartucho de carregamento de rodas múltiplas (Quorum Technologies Inc., Guelph, ON).

1. Brightfield - Lâmpada para 2,5 V e tempo de exposição a 240 ms.
2. Red Fluorescent Protein (RFP) - Ganho fixado em 140 para 200 ms.
3. Proteína Verde Fluorescente (GFP) - Ganho fixado em 140 para 500 ms.
4. Nosso microscópio tem uma lâmpada regulável em vez de um disco de fiação para controlar a quantidade de luz disponível para as células. Corremos nossos experimentos com a luz em 90% da intensidade máxima da lâmpada.

7. Tratamento das células com indutores da apoptose e 488 NucView Caspase-3 de substrato

1. É importante preparar grandes estoques de indutores de apoptose antes do tempo e congelá-los em alíquotas, de modo que as concentrações será consistente entre experimentos.
2. O NucView 488 substrato é sensível à luz. Preparar alíquotas de 15 mL para reduzir tubos de congelamento / descongelamento, e armazenar a -20 ° C coberto com papel alumínio. Trabalhar com a iluminação da sala ambiente tão baixa quanto possível para reduzir a exposição do NucVsubstrato iew 488 à luz, antes da sua utilização.
3. Recuperar a câmara de cultura rapidamente da incubadora para que as células não estão expostos a uma redução na temperatura. Coloque a câmara de cultura para a câmara ambiental do microscópio, e usar grampos para manter a câmara de cultura de movimento. Neste ponto, você também deve dim as luzes da sala.
4. Ligue o pré-misturados 5% de CO ₂ tanque com regulador dual.
5. Usando a objetiva de 10x, foco para encontrar células no monitor do computador usando microscopia de campo brilhante. Nota: você gostaria de usar a maior abertura numérica no objectivo com a ampliação desejada para reduzir o tempo de exposição.
6. Entregar indutores de apoptose das células (no nosso caso 80 mM de potássio, glutamato ou 100 mM), um dos seguintes métodos podem ser usados. Nós usaremos a entrega de 80 mM de potássio como um exemplo, utilizando KCl dissolvido como um concentrado 10x no nosso meio de cultura típica.
   1. Media Exchange by perfusão lenta e local:
      - Use uma bomba peristáltica para a mídia de troca na câmara de cultura com novas mídias contendo 80 mM de potássio.
      - Uma final da tubulação vai entregar 10 mL de um estoque de 80 mM de potássio dissolvido em DMEM livre de fenol, ea outra extremidade do tubo irá remover a mídia da câmara.
      - Você quer trocar um pelo menos 10x de mídia para garantir que o material deixado na câmara tem a concentração correta de potássio.
      - Depois de mídia é trocado, adicionar 3 mL de substrato NucView 488 para a mídia na câmara. Pipeta para misturar.
   2. Adição direta de 80 mM K ⁺ e NucView 488 substrato para a mídia na câmara de cultura:
      - Prepare uma solução estoque de 10x de 80 mM de potássio dissolvido em DMEM livre de fenol.
      - Adicionar 3 mL de substrato NucView 488-50 mL de potássio mM 10x 80. Pipeta para misturar. Adicionar a 500 mL de fenol livre de DMEM em câmara de cultura.
      Nota: este método épreferida se você estiver interessado em manter ou avaliação do crescimento ou outros fatores secretados que podem estar presentes na mídia original. Nós descobrimos que o 488 NucView substrato é estável em cultura de células para experimentos com duração até 36 h.

8. Live-célula de imagem

1. Clique no canal vermelho para mostrar células transfectadas.
2. Selecionar e salvar em torno de uma dúzia de quadros onde há várias células transfectadas, e salvar estes "pontos estágio XY". Dependendo da quantidade de memória de computador, você pode ser limitado ao número de pontos de estágio que você será capaz de adquirir.
3. Ter as imagens de microscópio de captura (em brilhante campo canal, vermelho, e canal verde) nestes estágios salvos pontos a cada 6 minutos.
4. Qualquer coloração verde que é visível durante as fases iniciais dos experimentos provavelmente indica células que já estão em apoptose, devido normalmente a transfecção e / ou estresse ambiental. Apoptosis devido a tratamentos experimentais serão detectados em um ponto no tempo no final do experimento.

9. Análise estatística

1. Para cada experimento, o programa de microscópio para adquirir pontos XY múltiplos para reunir um grande conjunto de dados de forma eficiente. Cada experimento é realizado em duplicata ou triplicata, e os dados são compilados a partir de experiências separadas realizadas em dias diferentes. De cada conjunto de dados, analisamos até 15 campos de ver e comparar a proporção de células caspase-negativos para caspase-células positivas (número total de células no campo de visão / número total de caspase-células positivas).

2. As medições gravadas de cada conjunto de dados são agrupados em um conjunto amostra maior, e depois são comparados entre si utilizando uma tabela ANOVA (p = 0,05). Nós mostramos os erros padrão da média (SEM) de cada experimento, e então comparar a diferença de meios através da realização de um teste de Tukey comparação das médias (p = 0,05) para determinar which tratamentos são significativamente diferentes umas das outras.

10. Resultados representante

Nós descrevemos um experimento para ilustrar como o NucView 488 substrato pode indicar um aumento da taxa de apoptose de N19-OLG culturas de células após um tratamento com uma alta concentração de potássio extracelular. O N19-células foram transfectadas com RFP, e eram tratadas com 3 mL NucView 488 substrato (controle), ou 3 mL NucView 488 substrato e 80 mM [K ^+] (o tratamento). As células foram monitorados e as imagens foram adquiridas ao longo de um curso de tempo 12 h, que é adequado para estudos envolvendo insultos neurológicos (Figura 1A). Em condições de controle, não foram observadas quantidades significativas de apoptose em relação ao 80 mM [K ^+] culturas tratadas (caixa de hash), que apresentou cerca de 45% de morte celular após 12 h (Figura 1B). O sinal de fundo verde observard nas condições de controle indica as células que estão apoptose sem a adição de potássio extracelular. Praticamente nenhuma das células no controle de apoptose exibem experimentar o ponto de tempo de 12 h, embora em outras situações os experimentos podem ser obrigados a longo prazo. As imagens foram adquiridas usando uma objetiva de 10x. Bar = 100 mm.

Figura 1. (A) A 12 h experimento tempo de curso do N19 culturas OLG 48 h pós-transfecção expressar RFP-MBP (canal vermelho), juntamente com 3 mL de substrato NucView 488 (canal verde). Culturas eram tratados com uma concentração final de 80 mM [K ^+] (painéis à esquerda), ou nenhum tratamento como controle (painéis à direita). Imagens foram obtidas em intervalos de 6 min e ativação significativa da caspase-3 (sinal verde) pode ser observard em culturas tratadas com 80 mM [K ^+] dentro do núcleo das células (caixa de hash) em comparação com o experimento de controle. (B) Percentagem de caspase-3 células (calculado pela divisão do número total de células no campo de visão por o número total de caspase-células positivas). Em comparação com condições de controle, observou-se em torno de 45% a morte das células seguintes K ^+-tratamento por 12 h.

SVideo 1. A 12 h experimento tempo de curso do N19-OLG culturas 48 h pós-transfecção expressar RFP-MBP (canal vermelho) com 3 mL de substrato NucView 488 (canal verde), juntamente com brilhante-campo e imagens de uma forma de três imagem fundida, após o tratamento com 80 mM [K ^+].

SVideo 2. A 12 h experimento tempo de curso do N19-OLG culturas 48 h pós-transfecção expressar RFP-MBP (canal vermelho) com 3 mL de substrato NucView 488 (canal verde), juntamente com brilhante-campo images e uma imagem de três vias mescladas. Nenhum tratamento foi aplicado para as culturas e N19-OLGs pode ser visto através da migração campo do microscópio em contraste com a cultura de células tratadas com 80 mM [K ^+] (compare com SVideo 1).

Discussão

Embora este não é o único produto fluorogênico disponíveis para a detecção de apoptose, existem várias vantagens significativas para usar o NucView 488 substrato. Um dos principais benefícios é a capacidade de acompanhar a apoptose em células vivas em tempo real, enquanto a maioria dos produtos alternativos, ou requerer a lise celular ou ter permeabilidade celular pobres. Outros benefícios incluem a alta sensibilidade para caspase-3, o reconhecimento de alta permeabilidade celular, baixa citotoxicidade, e nenhuma interferência com a progressão da apoptose. O substrato também tem fluorescência de fundo baixo até que ele é clivado e entra no núcleo, o que elimina fluorescência de fundo. A seqüência de caspase-3 reconhecimento contém 3 cargas negativas e o corante DNA-binding tem uma carga positiva ^2. O DEVD-NucView 488 molécula, portanto, tem uma carga líquida negativa, o que impede a ativação e ligação do corante ao DNA em células caspase onde não está ativo.

Maintaining consistência entre experimentos é necessário para ser capaz de estabelecer comparações significativas entre repetições. Um dos principais parâmetros para manter consistente é a densidade de células, como ela afeta a taxa de transfecção. Obtenção de taxas de transfecção alta em imortalizado N19-OLG culturas de células é mais difícil do que com outras linhagens de células comuns, tais como HeLa ou HEK293, e é altamente dependente de densidade, em nossa experiência ^{12, 13.} Nossos melhores eficiências de transfecção para estas células têm sido obtidos com Fugene HD (Roche) e são normalmente cerca de 15%, mas pode chegar a mais de 30%, dependendo da construção. Contagem de células cuidado ajudará na obtenção de taxas de transfecção consistente. Também é importante para expor as células de diferentes tratamentos para o mesmo grau de estresse ambiental, particularmente quando se mede as taxas de apoptose. Especificamente, o comprimento de tempo durante o qual as células são expostas a reagentes de transfecção, ou a quantidade de exposição à luz, são importantes variáveis ​​ambientaisveis a considerar, e deve permanecer constante em experimentos. Para nossas aplicações, descobrimos que a recolha de um grande número de campos de visão fornece uma amostra suficientemente grande para fazer comparações estatisticamente significativa [Ibidem].

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número Catálogo
NucView Kit 488 Caspase-3 Ensaio para células vivas	Biotium	30029
FuGENE reagentes de transfecção HD	Roche	04709705001
Modificado Dulbecco Eagle Medium	Gibco	31053-028
Tripsina 0,25%	Gibco	15050-065
Soro fetal bovino	Gibco	12483-020
Penicilina / estreptomicina	Gibco	15140122
# 1,5-25 milímetros vidro lamela	Warner Instruments	64-0715
Chamlide CMB magnética câmara de cultura para 25 milímetros lamela	Quorum Technologies	CM-B-40
Cellstart cultura de tecidos 10 pratos centímetros	VWR	82050-576
BD Falcon de 6 pratos bem a cultura de tecidos	VWR	CA62406-161