Monitoramento de Atividades de caspase-3 Clivadas e apoptose das células oligodendrogliais Imortalizado usando Live-célula Imaging and Cleaveable Fluorogênico-dye seguintes substratos de potássio induzida por despolarização da membrana

Este procedimento permite monitorar a morte celular glial por oligo DDR em tempo real. Isso é realizado primeiramente cultivando as células, depois preparando-as para a microscopia de imagem em células vivas. O próximo passo é aplicar um tratamento às células e monitorar os efeitos utilizando microscopia de fluorescência.

O passo final é realizar a análise dos dados. Em última instância, os resultados mostram as taxas de morte celular em uma população de células após um tratamento ou estímulo, monitorando a fluorescência nuclear proveniente de um corante fluorescente ativado por caspase. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a imunomarcação, é a capacidade de coletar múltiplos pontos temporais simultaneamente.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia celular, como as respostas a tratamentos farmacológicos, reagentes e diversos tratamentos. Atualmente, este método pode fornecer informações sobre a morte em culturas celulares. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como tecidos organotípicos ex vivo, incluindo fatias de cérebro.

De modo geral, indivíduos novos nesta técnica enfrentarão dificuldades ao se adaptarem ao trabalho com tecido vivo em vez de tecido fixado. A demonstração visual desta técnica é importante, pois existem muitos passos no preparo de amostras de células vivas em comparação com tecido fixado. Primeiro, descongele células gliais oligodendrocíticas imortalizadas N 19 em banho-maria a 37 graus Celsius enquanto as células estão descongelando.

Adicione sete mililitros de DMEM com alta concentração de glicose suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina a uma placa de cultura de 10 centímetros. Em seguida, adicione a suspensão celular gota a gota à placa e agite suavemente a placa de Petri para dispersar as células uniformemente. Incube as células a 34 graus Celsius em um incubador com 5% de dióxido de carbono por quatro horas após quatro horas.

Aspire o meio das placas para remover qualquer resíduo de crioprotetor DMSO. Substitua por sete mililitros de meio fresco após quatro a sete dias de crescimento. Quando as células atingirem 70 a 80% de confluência, aspire o meio e pipete um mililitro de tripsina sobre a monocamada celular, incubando à temperatura ambiente por cinco minutos.

Em seguida, colha as células e semeie-as em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros com as células colhidas numa densidade de 0,1 vezes 10 à sexta células por mililitro, e coloque esta placa no incubador de cultura de tecidos. Após mais uma passagem, as células podem ser semeadas para experimentos de imagem de células vivas. Para isso, colha as células como anteriormente, remova então 30 microlitros da suspensão celular e conte as células utilizando um hemocitômetro.

Em seguida, utilize pinças estéreis para colocar lamínulas de vidro não revestidas. Em poços de uma placa de seis poços, adicione células ao poço numa densidade de 0,1 vezes 10&sup6; células por mililitro. Em dois mililitros de meio DMEM com alta concentração de glicose, sem fenol, suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina, deixe as células crescerem durante a noite a 34 °C e 5% de dióxido de carbono antes da transfeção.

No dia seguinte, combine 100 microlitros de meio sem soro com 0,5 a quatro microgramas de plasmídeo purificado de DNA e quatro microlitros de FU gene hd. Vortexe suavemente a mistura duas vezes e, em seguida, deixe o DNA formar complexos à temperatura ambiente por cinco minutos. Após o tempo de incubação, adicione diretamente a mistura de DNA FU gene HD às células cultivadas.

Incline suavemente a placa para misturar. Em seguida, cultive as células por mais 48 horas a 34 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono antes do tratamento ou experimentação. Primeiro, ligue a caixa de controle do instrumento de imagem de células vivas LCI Cham.

Isso deve ser feito três horas antes do início do experimento para garantir o aquecimento completo da platina. No mínimo, a caixa de controle deve ser ligada uma hora antes do início do experimento. Em seguida, trabalhando em uma câmara de fluxo laminar, pulverize a câmara de cultura magnética tipo LCI Cham light e a pinça com etanol 70% e deixe secar por cinco minutos.

Retire as células do incubador e examine-as ao microscópio para confirmar que estão saudáveis. As células devem parecer duras e bem espalhadas sobre o lamínula de vidro, com numerosos prolongamentos membranosos. Células com um número reduzido de prolongamentos ou com núcleo de formato irregular provavelmente estão estressadas devido à transfeção e não são adequadas para experimentos adicionais realizados na câmara de fluxo.

Incline a placa de seis poços e remova a lamínula com pinça. Coloque rapidamente a lamínula com o lado das células voltado para cima no fundo da câmara. Não permita que a lamínula seque.

Em seguida, fixe o corpo magnético principal da câmara de cultura e adicione 500 microlitros de meio da placa de seis poços original sobre a parte superior do lamínula. A reutilização do meio reduz a quantidade de estresse imposta às células causado por alterações ambientais e também pode ser útil para avaliar fatores secretados extracelulares. Após a adição do meio, coloque o tampo de vidro sobre a câmara de cultura e utilize uma trança de lenços de papel Kim com 70% para remover qualquer material residual que possa interferir na microscopia da parte inferior do lamínula.

Coloque a câmara de cultura no incubador a 34 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Este passo garantirá que a própria câmara aqueça a 34 graus, reduzindo o deslocamento da lamínula. À medida que o metal aquece, é necessário trabalhar com a iluminação ambiente da sala tão baixa quanto possível durante os próximos passos.

Primeiro, Thora previamente preparou elequa de vista nuclear à temperatura ambiente. Em seguida, retire a câmara de cultura do incubador e coloque-a rapidamente na câmara ambiental do microscópio. Ligue o tanque de dióxido de carbono pré-misturado a 5% com regulador duplo.

Em seguida, utilizando a objetiva de 10 vezes com a lâmpada do microscópio ajustada em aproximadamente 2,5 volts e o tempo de exposição em 240 milissegundos, foque usando microscopia de campo claro para visualizar as células no monitor do computador. Em seguida, adicione uma concentração de 80 milimolar de íon potássio ou outro indutor de apoptose às células por meio de troca de meio com perfusão lenta e localizada utilizando uma bomba peristáltica.

O substrato nuke view 4 88 é estável em cultura celular para experimentos com duração de até 36 horas. Portanto, é possível realizar experimentos ao longo desse período de tempo. Primeiro, configure o microscópio para visualizar a fluorescência das proteínas fluorescentes verde e vermelha.

Em seguida, clique no canal vermelho para exibir as células transfectadas. Selecione e salve aproximadamente 12 quadros nos quais haja várias células transfectadas e salve esses pontos do estágio XY. Configure o microscópio para capturar imagens no canal de campo claro vermelho e no canal verde nesses pontos do estágio salvos a cada seis minutos.

Após coletar múltiplos pontos XY de experimentos duplicados ou triplicados, compile os dados de experimentos separados realizados em dias diferentes e realize a análise de dados e os testes estatísticos conforme descrito no protocolo escrito para comparar a razão entre células negativas para CASP bay e células positivas para CASP bay. O substrato Nuke view 4 88 pode indicar uma taxa aumentada de apoptose em culturas de células gliais oligo DDR N 19. Após um tratamento com alta concentração de potássio extracelular, essas imagens de referência foram adquiridas usando uma objetiva de 10 vezes.

As células N 19 foram transfectadas com RFP e tratadas com três microlitros de nuke view, substrato 4 88 para as células controle, ou com três microlitros de nuke view, substrato 4 88 e 80 milimolares de potássio. Essas imagens ilustram que o número de células apoptóticas aumenta ao longo do tempo, três, seis e nove horas após o tratamento com 80 milimolares de potássio. Em condições controle, quantidades significativas de apoptose não foram observadas em comparação com os cultivos tratados com 80 milimolares de potássio. O sinal verde de fundo observado nas condições controle indica as células que estão passando por apoptose sem a adição de potássio extracelular.

Um período de 12 horas é adequado para estudos que envolvem lesões neurológicas. Após 12 horas, as culturas tratadas com potássio demonstraram aproximadamente 45% de morte celular. Praticamente nenhuma das células no experimento controle exibiu apoptose no ponto temporal de 12 horas. Embora, em outras situações, os experimentos possam precisar ser realizados por um tempo mais longo.

Este gráfico mostra o aumento nas células positivas para caspase três ao longo do período de 12 horas do experimento. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma hora e os dados podem ser coletados durante a noite, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a consistência entre os tratamentos ao seguir este procedimento.

Outros métodos, como imunomarcação, podem ser utilizados para analisar outras proteínas downstream envolvidas nas vias estudadas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar amostras para imagem. Adquira um conjunto de dados e analise seus dados.