Monitoramento de Atividades de caspase-3 Clivadas e apoptose das células oligodendrogliais Imortalizado usando Live-célula Imaging and Cleaveable Fluorogênico-dye seguintes substratos de potássio induzida por despolarização da membrana

Este procedimento permite que a morte de células gliais oligo DDR seja monitorada em tempo real. Isso é feito primeiro cultivando as células e, em seguida, as células são preparadas para imagens de células vivas. O próximo passo é fornecer um tratamento para as células e monitorar os efeitos usando microscopia de fluorescência.

A etapa final é realizar a análise dos dados. Em última análise, os resultados mostram taxas de morte celular em uma população celular após um tratamento ou estímulo, monitorando a fluorescência nuclear de um corante fluro ativado por caspase. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a imunocoloração, é a capacidade de reunir vários pontos de tempo simultaneamente.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biologia celular, como respostas a tratamentos farmacológicos, reagentes e diversos. Agora, esse método pode fornecer informações sobre a morte dentro das culturas de células. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como ex vivo, tecidos organotípicos, incluindo fatias de cérebro.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades ao se ajustarem ao trabalhar com tecido vivo em vez de tecido fixo. A demonstração visual dessa técnica é importante, pois há muitas etapas para preparar amostras de células vivas em comparação com o tecido fixo. Primeiro descongele as células gliais N 19 oligo droog congeladas imortalizadas em banho-maria de 37 graus Celsius enquanto as células estão descongelando.

Adicione sete mililitros de DMEM com alto teor de glicose suplementado com 10% de FBS e 1% de estreptomicina de penicilina a uma placa de cultura de 10 centímetros. Em seguida, adicione a suspensão celular gota a gota à placa e agite suavemente a placa de Petri para dispersar as células uniformemente. Cultive as células a 34 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5 centavos por quatro horas após quatro horas.

Aspire a mídia das placas para remover qualquer DMSO restante. Crioprotetor. Substitua por sete mililitros de meio fresco após quatro a sete dias de crescimento. Quando as células atingirem 70 a 80% de confluência, aspire o meio e pipete um mililitro de gotejamento na folha de células, incubado em temperatura ambiente por cinco minutos.

Em seguida, colha as células na próxima semente, uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros com as células colhidas a uma densidade de 0,1 vezes 10 elevado a seis células por mililitro, e coloque esta placa na incubadora de cultura de tecidos. Após mais uma massagem, as células podem ser revestidas para experimentos de imagem de células vivas. Para fazer isso, colha as células como antes, remova 30 microlitros da suspensão celular e conte as células usando um hemocitômetro.

Em seguida, use uma pinça estéril para colocar lamínulas de vidro não revestidas. Nos poços de uma placa de seis poços, adicione células ao poço a uma densidade de 0,1 vezes 10 elevado a seis células por mililitro. Em dois mililitros de meio DMEM livre de fenol, o alto teor de glicose suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina estreptomicina permite que as células cresçam durante a noite a 34 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono antes da transfecção.

No dia seguinte, combine 100 microlitros de meio livre de soro 0,5 a quatro microgramas de plasmídeo purificado, DNA e quatro microlitros de gene FU hd. Suavemente vórtice a mistura duas vezes e, em seguida, deixe o DNA complexar em temperatura ambiente por cinco minutos. Após o tempo de incubação, adicione a mistura de DNA HD do gene FU diretamente às células cultivadas.

Incline o prato suavemente para misturar. Em seguida, cultive as células por mais 48 horas a 34 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono antes do tratamento ou experimentação. Primeiro ligue a caixa de controle do instrumento de célula viva LCI Cham.

Isso deve ser feito três horas antes do início do experimento para garantir o aquecimento completo do estágio. No mínimo, a caixa de controle deve ser ligada uma hora antes de iniciar o experimento. Em seguida, trabalhando em uma capela de fluxo, pulverize a câmara de cultura do tipo magnético leve LCI Cham e a pinça com etanol 70% e deixe-os secar por cinco minutos.

Remova as células da incubadora e examine-as ao microscópio para confirmar se estão saudáveis. As células devem aparecer de forma duradoura e bem espalhada na lamínula de cobertura de vidro com vários processos de membrana. Células com um número reduzido de extensões de processo ou um núcleo de formato irregular provavelmente são estressadas pela transfecção e são inadequadas para outros experimentos trabalhando na capela de fluxo.

Incline a placa de seis poços e remova a lamínula com uma pinça. Coloque rapidamente a lamínula de cobertura com o lado da célula voltada para cima na placa inferior da câmara. Não deixe a lamínula secar.

Em seguida, conecte o corpo principal magnético da câmara de cultura e adicione 500 microlitros de mídia da placa original de seis poços na parte superior da lamínula. A reutilização do meio diminui a quantidade de estresse colocado nas células causada por mudanças ambientais e também pode ser útil para avaliar fatores secretados extracelulares. Depois que a mídia for adicionada, coloque a tampa de vidro na câmara de cultura e use uma trança de lenços umedecidos Kim com 70% para remover qualquer material residual que possa interferir na microscopia da parte inferior da lamínula.

Coloque a câmara de cultura na incubadora de 34 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Esta etapa garantirá que a própria câmara aqueça os 34 graus para reduzir o deslocamento da lamínula. À medida que o metal aquece, é necessário trabalhar com a iluminação ambiente o mais baixa possível durante as etapas a seguir.

Primeiro, Thora preparou anteriormente elequa de visão nuclear à temperatura ambiente. Em seguida, recupere a câmara de cultura da incubadora e coloque-a rapidamente na câmara ambiental do microscópio. Ligue o tanque de dióxido de carbono pré-misturado de 5% com regulador duplo.

Em seguida, usando a objetiva de 10 vezes com a lâmpada do microscópio ajustada para cerca de 2,5 volts e o tempo de exposição para 240 milissegundos. Foco usando microscopia de campo claro para visualizar as células no monitor do computador. Em seguida, adicione uma concentração de 80 milimolares de íon potássio ou outro indutor de apoptose às células por meio de troca de meios com perfusão lenta e local usando uma bomba peristáltica.

O substrato nuke view 4 88 é estável em cultura de células para experimentos com duração de até 36 horas. Portanto, é possível realizar experimentos durante esse período de tempo. Primeiro configure o microscópio para visualizar a fluorescência da proteína fluorescente vermelha e verde.

Em seguida, clique no canal vermelho para exibir as células transfectadas. Selecione e salve aproximadamente 12 quadros onde há várias células transfectadas e salve esses pontos do estágio XY. Faça com que o microscópio capture imagens no canal vermelho de campo claro e no canal verde nesses pontos de estágio salvos a cada seis minutos.

Depois de coletar vários pontos XY de experimentos duplicados ou triplicados, compile os dados de experimentos separados realizados em dias diferentes e realize análises de dados e testes estatísticos conforme descrito no protocolo escrito para comparar a proporção de células negativas do compartimento CASP e células positivas do compartimento CASP. O substrato Nuke view 4 88 pode indicar um aumento da taxa de apoptose de culturas de células gliais N 19 oligo DDR. Após um tratamento com alta concentração de potássio extracelular, essas imagens basais foram adquiridas usando uma objetiva de 10 vezes.

As células N 19 foram transfectadas com RFP e foram tratadas com três microlitros de visão nuke, 4 88 substrato para células de controle ou três microlitros de visão nuke, 4 88 substrato e 80 milimolar de potássio. Essas imagens ilustram que o número de células apoptóticas aumenta com o tempo, três, seis e nove horas após o tratamento com potássio 80 milimolar em condições de controle, quantidades significativas de apoptose não foram observadas em comparação com as culturas tratadas com potássio 80 milimolares. O sinal verde de fundo observado nas condições de controle indica as células que estão sofrendo apoptose sem a adição de potássio extracelular.

Um curso de 12 horas é adequado para estudos envolvendo insultos neurológicos Após 12 horas, as culturas tratadas com potássio demonstraram aproximadamente 45% de morte celular. Praticamente nenhuma das células do experimento de controle exibe apoptose no ponto de tempo de 12 horas. Embora em outras situações, os experimentos possam ser necessários para serem executados por mais tempo.

Este gráfico mostra o aumento da caspase de três células positivas ao longo do tempo do experimento de 12 horas. Uma vez importunada, essa técnica pode ser feita em uma hora e os dados podem ser coletados durante a noite, se feitos corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser consistente entre os tratamentos após este procedimento.

Outros métodos, como a imunocoloração, podem ser usados para observar outras proteínas a jusante envolvidas nas vias estudadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar amostras para imagens. Adquira um conjunto de dados e analise seus dados.