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Propagação e detecção de um Clone Infecciosas Molecular da Maedi-visna vírus que expressa a proteína fluorescente verde

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DOI:

10.3791/3483

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9 de outubro de 2011

 , 
1Institute for Experimental Pathology, University of Iceland

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos um clone molecular da Maedi-visna vírus que expressa a GFP e é totalmente infecciosas. Replicação deste vírus pode ser detectado por meio de microscopia de fluorescência e citometria de fluxo.

Resumo

Maedi-visna (MVV) é um lentivírus de ovelhas, fazendo com que lentamente progressiva pneumonia intersticial e encefalite 1. As células-alvo primário do MVV in vivo são consideradas das duas linhagem de monócitos. Determinadas estirpes de MVV pode replicar em outros tipos de células, no entanto 3,4. A proteína verde fluorescente é um marcador comumente usado para estudar lentivírus em células vivas. Temos inserido o gene EGFP no gene para dUTPase de MVV. O gene dUTPase está bem conservado em cepas mais lentivírus de ovinos e caprinos e tem se mostrado importante na replicação do CAEV 5. No entanto, dUTPase foi mostrado para ser dispensáveis ​​para a replicação do clone molecular de MVV utilizados neste estudo in vitro e in vivo 6. Replicação MVV é estritamente confinada às células de ovelhas ou cabras origem. Nós usamos uma linhagem de células primárias do plexo coróide de ovelhas (células SCP) para transfecção e propagação do vírus 7. O MVV fluorescentes é totalmente infecciosas e expressão EGFP é estável durante pelo menos seis passagens 8. Há boa correlação entre as medidas de TCID 50 e EGFP. Este vírus deve ser útil para a detecção rápida de células infectadas em estudos de tropismo celular e patogenicidade in vitro e in vivo 8.

Protocolo

1. Transfecção

O clone molecular está contida em dois plasmídeos, p8XSp5-EGFP e p67r, de 12 kb e 4,5 kb, respectivamente. 9,10

  1. Corte quantidades equimolares dos dois plasmídeos, ou seja, 4,4 mg de p8XSp5-EGFP e 1,6 mcg de p67r com XbaI e ligar antes de transfecção.
  2. Para a ligadura, use uma unidade de Weiss de ligase em uma reação de 50 ul e incubar a 16 ° C durante a noite.
  3. Quando a ligadura é completada, incubar a mistura de ligadura a 65 ° C por 15 min para inativação da ligase. Este passo pode ser omitido.
  4. Dois dias antes de semente de transfecção, 10 6 células SCP num frasco de cultura de tecidos T25, e cultivar células por dois dias em 5 ml DMEM + 10% de soro de carneiro e glutamina 2mM sem antibióticos para uma monocamada de 90% confluência. Se as células não tiverem alcançado 90% confluência depois de dois dias, deixar as células a crescer um dia adicional.

Nota: O soro de cordeiro pode ser substituído por soro fetal bovino (FBS). Nós usam rotineiramente cordeiro soro, uma vez que algumas cepas de MVV são inibidas por FBS; esta estirpe MVV não é inibida por FBS, no entanto.

  1. Quando as células estão prontos para a transfecção, as alterações médio e DMEM com soro 1% (soro ou cordeiro FBS) sem antibióticos.
    Usamos Lipofectamin 2000 (Invitrogen) para transfecção.
  2. Diluir o DNA em 500μl médio Opti-MEM.
  3. Diluir 20μl Lipofectamin 2000 em 500μl médio Opti-MEM e deixe em temperatura ambiente (RT) por 5 min.
  4. Após a incubação de 5 minutos, misture o DNA diluído com Lipofectamine diluída 2000 (volume total = mL 1000). Misture delicadamente e incubar por 20-30 min em temperatura ambiente.
  5. Adicione a mistura de transfecção (1 ml) para o frasco contendo células T25 SCP e médias empresas (5 ml). Mix movimentando-se suavemente.
  6. Incubar a 37 ° C e 5% CO 2 durante a noite (18-24 h).
  7. Mudar o dia do meio a seguir para DMEM com soro 1%, 2mM de glutamina, penicilina e estreptomicina 100IU 100IU.
  8. Monitorar a produção de GFP em células SCP por microscopia fluorescente invertido. Eficiência de transfecção baixo pode ser esperado com essas células primárias, geralmente 5-15%.
  9. Incubar mais tempo, a 37 ° C, 5% CO 2 por vários dias para permitir a propagação do vírus no frasco. Ele normalmente leva 7-14 dias para a infecção por completo.
  10. Recolher o vírus por alíquotas do sobrenadante em tubos Eppendorf. Girar em uma microcentrífuga a 3000 rpm por 5 min para remover restos celulares. Transferir o sobrenadante contendo o vírus para novos tubos. Armazenar a -80 ° C.

2. Titulação do vírus

  1. Semente de 3x10 4 células SCP em 100 mL meio DMEM suplementado com soro de 10%, a glutamina 2mM, penicilina e estreptomicina 100IU/ml 100IU/ml, por bem em uma placa de 96 poços. Incubar a 37 ° C, 5% CO 2.
  2. Se as células são confluentes no dia seguinte, a mudança médio e DMEM com soro 1%, a glutamina 2mM, penicilina e estreptomicina 100IU/ml 100IU/ml, 100 l em cada poço.
  3. Diluir o vírus da seguinte forma:
    1. Adicionar 180 mL DMEM com soro 1%, 2mM de glutamina, penicilina e estreptomicina 100IU/ml 100IU/ml por poço de 4 x 10 poços em um fundo de 96 poços redondos ou V-bottom prato.
    2. Para diluições em série de dez vezes em quatro vias, adicionar 20 mL de vírus a cada um dos 4wells na primeira coluna da placa, e usando uma pipeta de quatro canais, pipeta cima e para baixo para garantir que as amostras sejam bem misturados. Trocar a ponteira e transferir 20 l para os próximos quatro poços e assim por diante. Deixe o passado sem poços de vírus para controle negativo.
  4. Adicione 100 ml das diluições do vírus às células SCP e médias empresas.
  5. Incubar a 37 ° C e 5% CO 2. Observe para GFP fluorescência e efeitos citopáticos por duas semanas.
    Efeitos citopáticos são constituídas por células arredondadas e tornando-se menos transparentes do que as células normais com os processos que se estende para fora, terminando com as multinucleares aparecendo e morte celular.
  6. Calcule vírus título (TCID50), utilizando o método Reed Muench 11.

3. FACS análise de células infectadas

Nota: Para o monitoramento rápido de replicação do vírus, as células infectadas podem ser examinadas por citometria de fluxo.

  1. Trypsinize células infectadas (10 ca 5), lavar com PBS 1x e ressuspender em 500μl de PBS.
  2. Adicionar 500 mL de solução de paraformaldeído 4% (2% de concentração final), incubar a RT por 30 min.
  3. Células sedimento em uma microcentrífuga a 3000 rpm por 5 min.
  4. Lavar com PBS 2x5 min e analisar em um analisador FACScan. Contagem de 10.000 eventos.

4. Resultados representativos:

Este vírus devem ser totalmente infecciosas e replicar a um título de 10 junho - 10 julho TCID 50 ml /. Células infectadas são fluorescentes e pode ser detected por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Tipicamente, GFP pode ser detectada em mais de 60% das células em cultura de células infectadas por citometria de fluxo (Fig. 1). Da mesma forma, quando visualizados por microscopia de fluorescência, a maioria das células são fluorescentes (Fig. 2A e B).

Figura 1
Figura 1. FACScan análise de células infectadas com o SCP KV1772-EGFP vírus após 7 dias de infecção.

Figura 2
Figura 2. Microscopia de contraste de fase de células infectadas com o SCP KV1772-EGFP após 7 dias de incubação (A). Mesmas células visualizadas por microscopia de fluorescência (B).

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Discussão

A GFP expressar clone molecular de MVV aqui apresentados deve ser útil para analisar as interações da célula hospedeira e patogenicidade do MVV tanto in vitro como in vivo. O vírus obtidos após 7-14 dias de replicação, sem dúvida, adquiriu algumas mutações devido à imprecisão da transcriptase reversa. No entanto, existem limitações para o uso deste clone como um vetor único ciclo. Uma delas é que o uso do clone é restrita a células de ovelhas e cabras de origem. A eficiência de transfecção destas células usando nossa co...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Pesquisa da Islândia e da Universidade da Islândia Fundo de Investigação.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de catálogo
DMEM Gibco 10938025
Opti-MEM Gibco 51985018
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019

Referências

  1. Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).
  2. Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes. J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).
  3. Andresdottir, V. Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus. Virus Genes. 16, 281-293 (1998).
  4. Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence. Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).
  5. Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions. J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).
  6. Petursson, G. Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity. J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).
  7. Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. Cultivation of visna virus in tissue culture. Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).
  8. Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein. J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).
  9. Andresson, O. S. Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus. Virology. 193, 89-105 (1993).
  10. Skraban, R. Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype. J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).
  11. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
  12. Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity. Virology. 279, 116-129 (2001).

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