Imagem Confocal Espectral de fluorescência com a tag receptores nicotínicos na Knock-em camundongos com a administração de nicotina crônica

Resumo

Nós desenvolvemos uma nova técnica de quantificar as alterações de receptores de acetilcolina nicotínicos no interior das regiões subcelulares de subtipos específicos de neurónios no SNC a compreender melhor os mecanismos da dependência da nicotina, usando uma combinação de abordagens, incluindo a marcação da proteína fluorescente do receptor usando o arrastamento na abordagem e espectral imagiologia confocal.

Resumo

Canais ligando-iônicos no sistema nervoso central (CNS) estão implicados em numerosas condições com sérias consequências médicas e sociais. Por exemplo, dependência de nicotina através de fumo de tabaco é a principal causa de morte prematura em todo o mundo (Organização Mundial de Saúde) e é provavelmente causada por uma alteração de ião canal de distribuição no cérebro ^1. Exposição crónica de nicotina em ambos os roedores e os resultados seres humanos em aumento do número de receptores de acetilcolina nicotínicos (nAChRs) no tecido cerebral ^1-3. Da mesma forma, alterações nas glutamatérgicos GluN1 ou GluA1 canais têm sido implicados no desencadeamento de sensibilização a outras drogas como a cocaína, as anfetaminas e opiáceos ^4-6.

Consequentemente, a capacidade de mapear e quantificar a distribuição e os padrões de expressão de canais iónicos específicos é criticamente importante para a compreensão dos mecanismos de dependência. O estudo do cérebro específico de região efciais de drogas individuais foi avançada pelo advento de técnicas como ligantes radioativos. No entanto, a baixa resolução espacial de ligação do ligando radioactivo evita a possibilidade de quantificar canais ligando-iônicos em subtipos específicos de neurónios.

Codificados geneticamente repórteres fluorescentes, tais como a proteína verde fluorescente (GFP) e suas variantes de cor muitos, têm revolucionou o campo da biologia ^7. Por marcação geneticamente um repórter fluorescente para uma proteína endógena se pode visualizar as proteínas in vivo ^7-10. Uma vantagem das proteínas fluorescentes de marcação com uma sonda é a eliminação do uso de anticorpos, que têm problemas de inespecificidade e acessibilidade à proteína alvo. Nós temos usado essa estratégia para nAChRs fluorescente rótulo, o que permitiu o estudo do conjunto receptor usando Förster Resonance Energy Transfer (FRET) em cultura de células transfectadas ^11. Mais recentemente, temos utilizado a Knock-na abordagem aos ratos engenheiro com proteína fluorescente amarela marcado α4 subunidades (nAChR α4YFP), permitindo a quantificação exacta do ex vivo receptor em resolução submicrométricas em neurônios do sistema nervoso central através de microscopia confocal espectral ^12. O alvo fluorescente knock-in mutação é incorporado no locus endógeno e sob o controlo do seu promotor nativo, produzindo níveis normais de expressão e regulação do receptor, quando comparado aos receptores não marcados em ratinhos de tipo selvagem. Esta abordagem knock-in pode ser estendido para marcar fluorescentemente canais iónicos outros e oferece uma abordagem poderoso de visualizar e quantificar os receptores do SNC.

Neste artigo descrevemos uma metodologia para quantificar as mudanças na expressão nAChR em neurônios específicos do SNC após exposição crônica à nicotina. Nossos métodos incluem mini-implante de bomba osmótica, a fixação de perfusão intracardíaca, imagem e análise de fluorescência marcado rec nicotínicosubunidades eptor de α4YFP knock-em ratinhos (Fig. 1). Temos optimizada a técnica de fixação para minimizar a partir de autofluorescência tissue.We cérebro fixo descrever em detalhe a nossa metodologia de imagem utilizando um microscópio confocal espectral em conjunto com um algoritmo de desmistura linear espectral para subtrair o sinal autofluoresent, a fim de obter com precisão o sinal de fluorescência α4YFP. Finalmente, mostra resultados de upregulation nicotina induzida crónica de receptores α4YFP no caminho perfurante medial do hipocampo.

Protocolo

1. Implantação da bomba

1. Antes da implantação da bomba, preencher e preparar os Alzet mini-bombas osmóticas (Alzet, Modelo 2002, Cupertino, EUA), tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar. Este modelo de mini-osmótica bomba fornece solução a uma taxa de 0,5 ul / h durante 14 dias. Garantir condições estéreis. Pesar bombas vazias e cheias. Na conclusão da experiência (10 dias após o implante), o líquido remanescente na bomba pode ser removido com uma seringa e agulha e pesados ​​para calcular o volume bombeado.
2. Bombas com a solução de controlo contêm salina (0,9% w / v, Teknova, S5819, Hollister, EUA). Para preparar as soluções de nicotina, ....

Discussão

O uso de um receptor de fluorescente num modelo de rato knock-se para determinar a quantidade e localização de um canal de ião específico fornece um número de vantagens. Em contraste com as proteínas, tais como actina, que é ubíqua expressa em todas as células, os canais de iões estão presentes em números muito menos ea sua expressão varia entre os subtipos neuronais tornando a análise exacta através tradicionais técnicas imuno-histoquímicas desafio. O produto do gene α4YFP é expresso em níveis de TP, estando sob o c.......

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
mini-bombas osmóticas	Alzet	modelo 2002
salina	Teknova	S5819
(-)-Nicotina sal tartarato de hidrogénio	Sigma	N5260
colírio	Novartis	Lágrima-Gel
Vetbond cola	3M	1469SB
sal heparina sódica	Sigma	H4784
PBS 10x	Invitrogen	70011
ketamina	Wyeth Saúde Animal	0856-4403-01
cloridrato medatomidine	Pfizer	1950673
23G agulha borboleta	Becton Dickinson	367253
paraformaldeído	Electron Microscopy Sciences	15710
molde plástico de encaixe	VWR	18986-1
Composto outubro de montagem	Tissue-Tek	4583
Mowiol 4-88	EMD-Calbiochem	475904	pH 8,5