Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

Resumo

Um ensaio de freqüência de adesão para medir cinética de interação receptor-ligante, quando ambas as moléculas estão ancoradas nas superfícies das células que interagem é descrito. Este ensaio mecanicamente baseado é exemplificado usando uma micropipeta pressurizado glóbulo vermelho humano como sensor de adesão e integrinas αLβ2 e molécula-1 de adesão intercelular como interagindo receptores e ligantes.

Resumo

O ensaio de adesão micropipeta foi desenvolvido em 1998 para medir a duas dimensões (2D) receptor-ligante cinética de ligação ^1. O ensaio utiliza uma célula vermelha do sangue humano (RBC) como sensor de adesão e apresentar célula de uma das moléculas que interagem. Ela emprega micromanipulação para trazer o RBC em contato com outra célula que expressa a molécula de interagir com outras área controlada com precisão e tempo para permitir a formação de vínculo. O evento de adesão é detectado como alongamento RBC em cima puxando as duas células separadas. Ao controlar a densidade dos ligantes imobilizados na superfície RBC, a probabilidade de adesão é mantido em mid-range entre 0 e 1. A probabilidade de adesão é estimada a partir da freqüência de eventos de aderência em uma seqüência de ciclos de repetição do contato entre as duas células de um determinado tempo de contato. Variando o tempo de contato gera uma curva de ligação. Montagem de um modelo probabilístico para o receptor-ligante reação cinética de ¹ a a ligaçãocurva retorna a afinidade 2D e desconto na tarifa.

O teste foi validado usando interações de receptores Fcγ com IgG Fc ^1-6, selectinas com ligantes glicoconjugada ^6-9, integrinas com ligantes ^10-13, homotypical caderina vinculativo ^14, T receptor celular e co-receptor com complexos peptídeo-major de histocompatibilidade ^{15 - 19.}

O método tem sido utilizado para quantificar os regulamentos da cinética 2D por fatores biofísicos, tais como a membrana microtopology ^5, membrana âncora ^2, orientação molecular e comprimento ^6, rigidez transportadora ^{9, 20} curvatura, e força impingement ^20, bem como os fatores bioquímicos, tais como moduladores do microambiente citoesqueleto e membrana onde as moléculas interagem e reside na organização superfície dessas moléculas ^15,17,19.

O método também foi usado to estudo a ligação simultânea de dupla receptor-ligante ^3,4 espécies e interações trimolecular ¹⁹ usando um modelo modificado ^21.

A principal vantagem do método é que ele permite estudo de receptores de membrana em seu ambiente nativo. Os resultados poderiam ser muito diferentes daqueles obtidos com receptores purificada ^17. Ele também permite estudo das interações receptor-ligante em uma escala de tempo sub-segundo, com resolução temporal muito além dos métodos típicos bioquímicos.

Para ilustrar o método de freqüência de adesão micropipeta, mostramos a cinética de medição da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) em hemácias funcionalizados ligação a integrina β α _{L 2} em neutrófilos com dimérica E-selectina na solução para ativar α β _{L 2.}

Protocolo

1. RBCs isolamento do sangue total

1. Prepare EAS-45 soluções. Pesar até todos os ingredientes da Tabela I e dissolver em 100-200ml de água DI. Adicionar água para fazer a solução de 1000ml e ajustar o pH para 8,0. Filtrar e alíquota, de acordo 50ml. Congelar a -20 ° C para armazenamento.

Nota: Passo 1.2 deve ser realizada por um médico treinado profissional, como enfermeira, com um Conselho de Revisão Institucional protocolo aprovado.

2. Desenhe 3-5ml de sangue da veia cubital mediana em um tubo de 10 ml contendo EDTA e delicadamente misturar o sangue com EDTA imediata e cuidadosamente p....

Discussão

Para usar com sucesso o ensaio de micropipeta freqüência de adesão deve-se considerar várias etapas críticas. Primeiro, certifique-se de registrar a interação específica para o sistema de receptor-ligante de interesse. Medidas de controle não-específica (cf. fig. 3, 4) garantir a especificidade. Idealmente, as probabilidades de adesão não específica deve ser inferior a 0,05 para todas as durações de tempo de contato e ter uma diferença significativa entre as probabilidades de adesão específicas e não específicas para ca.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Catálogo #	Comentários
PBS 10x	BioWhittaker	17-517Q	Diluir a 1x com água deionizada antes do uso
Vacutainer EDTA	BD	366643	Isolamento RBCs
10ML PK100
Histopaque 1077	Sigma-Aldrich	10771	Isolamento RBCs
Adenina	Sigma-Aldrich	A2786	EAS-45 de preparação
D-glicose (dextrose)	Sigma-Aldrich	G7528	EAS-45 de preparação
D-Manitol	Sigma-Aldrich	6360	EAS-45 de preparação
Cloreto de sódio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	EAS-45 de preparação
Fosfato de sódio dibásico (Na & # x2082; HPO ₄)	Fisher Scientific	S374	EAS-45 de preparação
L-glutamina	Sigma-Aldrich	G5763	EAS-45 de preparação
Biotina-X-NHS	Calbiochem	203188	Biotinilação RBCs
Dimetilformamida (DMF)	Thermo Scientific	20673	Biotinilação RBCs
Borato tampão (0,1 M)	Microscopia Eletrônica de Ciências	11455-90	Biotinilação RBCs
Estreptavidina	Thermo Scientific	21125	Ligante funcionalização
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	Ligante funcionalização
Beads Quantibrite PE	BD Biosciences	340495	Quantificação da densidade
Citômetro de fluxo	BD Immunocytometry Sistemas	BD LSR II	Densidade quantificação
Tubo capilar 0.7-1,0 milímetros x 30 "	Kimble Glass Inc.	46.485-1	Micropipeta puxando
Óleo mineral	Fisher Scientific	BP2629-1	Câmara de montagem
Tampa de vidro de microscópio	Fisher Scientific	12-544-G	Câmara de montagem
PE α-humano CD11a Clone HI 111	eBioscience	12-0119-71	Reagente para Fig.1
PE anti-CD54 humano	eBioscience	12-0549	Reagente para Fig.1
IgG1 Isotype Controle PE	eBioscience	12-4714	Reagente para Fig.1
micromanipulador hidráulico	Narishige	MO-303	Micropipeta sistema
Manipulador mecânico	Newport	461-xyz-m, SM-13, DM-13	Micropipeta sistema
Tradutor piezoelétrico	Physik Instrumente	P-840	Micropipeta sistema
LabVIEW	National Instruments	Versão 8.6	Micropipeta sistema
DAQ bordo	National Instruments	USB-6008	Micropipeta sistema
Tabela óptica	Cinética de Sistemas	5200 Series	Micropipeta sistema