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Artigo de método

Induzir o crescimento dendrítico no cultivadas neurônios simpáticos

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⸱

DOI:

10.3791/3546

⸱

21 de março de 2012

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, University of California, Davis

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos um protocolo para a utilização de proteína morfogenética óssea-7 (BMP-7) ou Matrigel para selectivamente induzir o crescimento dendrítica em primárias neurónios simpáticos dissociadas do gânglio cervical superior (SCG) de ratos neonatais.

Resumo

A forma do mandril dendrítica determina a entrada total sináptica um neurónio pode receber 1-3, e influencia os tipos e distribuição destes 4-6 entradas. Padrões alterados de crescimento dendrítica e plasticidade estão associados com a função neurocomportamental prejudicada em modelos experimentais 7, e são pensados ​​para contribuir para os sintomas clínicos observados em ambas as 8-10 neurodesenvolvimento distúrbios e doenças neurodegenerativas 11-13. Tais observações ressaltam a importância funcional da regulação precisamente morfologia dendrítica, e sugerem que a identificação de mecanismos que controlam o crescimento dendrítico não só avançar na compreensão de como a conectividade neuronal é regulado durante o desenvolvimento normal, mas também pode fornecer informações sobre novas estratégias terapêuticas para diversas doenças neurológicas.

Estudos sobre os mecanismos de crescimento dendrítico seria grandemente facilitada pela disponibilidade ofa sistema modelo que permite que os neurónios a ser experimentalmente comutada a partir de um estado em que não se estendem para uma dendritos em que elaborar um mandril dendrítica comparável à do seu em homólogos in vivo. Culturas primárias de neurônios simpáticos dissociados do gânglio cervical superior (GCS) de roedores perinatais fornecer tal modelo. Quando cultivados em meio definido na ausência de soro e ganglionar células gliais, neurónios simpáticos estender um único processo que é axonal, e este estado unipolar persiste durante semanas a meses em cultura 14,15. No entanto, a adição de qualquer proteína morfogenética óssea-7 (BMP-7) ou 16,17 Matrigel 18 ao meio de cultura desencadeia estes neurónios para estender vários processos que satisfaçam os critérios morfológicos e bioquímicos e funcional para dendrites. Neurônios simpáticos dissociadas do SCG de roedores perinatais e cultivadas sob condições definidas são uma população homogênea de neurônios 19que respondem de forma uniforme para a actividade promotora de dendrite-Matrigel, BMP-7 e BMPs outros do decapentaplegic (DPP) e subfamílias 60A 17,18,20,21. Importante, Matrigel e BMP-induzida dendrite formação ocorre na ausência de alterações na sobrevivência das células ou do crescimento axonal 17,18.

Aqui, nós descrevemos como configurar culturas dissociadas de neurónios simpáticos SCG derivados da de ratos perinatais de modo que eles são responsivos à actividade dendrite-promoção selectiva de Matrigel ou BMPs.

Protocolo

1. Preparação de meio de cultura (meio de C2)

  1. Adicionar o seguinte, na ordem listada, para um estéril, 500 ml descartável Erlenmeyer:
    Quantidade Componente Concentração Final
    190 ml DMEM (glicose baixa) N / A
    10 ml de ácido gordo livre de BSA (20mg/ml em DMEM) 50 ug / ml
    2,8 ml L-Glutamina 1,4 mM
    4 ml insulina / transferrina / selénio (100x) 10 ug / ml de insulina 5,5 ug / ml de transferrina 38,7 nM de selénio
    0,4 ml NGF (125 ug / ml) 100 ng / ml
    200 ml Ham F-12 N / A
  2. Agite suavemente to mix e alíquota de 10 ml por tubo de 17 x 100 tubos estéreis tampa de pressão.
  3. Armazenar a -80 ° C
  4. Notas importantes:
    • Descongele NGF imediatamente antes do uso.
    • Antes de alíquotas da solução de estoque de NGF, pré-revestimento das paredes interiores do pipeta de plástico de cultura de tecidos serológica com a proteína para minimizar aderência de NGF para o plástico. Abordagem mais fácil é a Pipetar a mistura DMEM contendo os tempos de BSA vários. Lavar o tubo de NGF por várias vezes com a mistura de DMEM.
    • Adicionar F-12 passado porque cisteína livre pode desestabilizar ligações dissulfureto na insulina.
    • Não congelar em volumes superiores a 10 ml por CaPO4 cristais podem formar
    • Não congelar e descongelar C2 médio mais de 2 vezes.

2. Preparação de lamínulas

  1. Descobrimos que só finas lamínulas alemães trabalhar de forma consistente neste protocolo (ver Tabela 1 para fonte recomendada e número de catálogo).
  2. Adicionar 75-100 ml de 70% de ácido nítrico a 300 ml de garrafas de vidro de amostras de politetrafluoroetileno (PTFE forros ou Teflon) da tampa (Fisher # catálogo 09-911-765).
  3. O uso de luvas, gota lamelas uma por uma, para a solução de ácido nítrico. Adicionar lamelas suficientes para fazer uma camada de não mais do que 2-3 lamelas de espessura no fundo do frasco.
  4. Agitar suavemente os recipientes com as lamelas durante 6-8 horas à temperatura ambiente em um conjunto agitador orbital durante não mais do que 185 rpm.
  5. Trabalhando em um exaustor, decantar cuidadosamente o ácido e eliminar de acordo com os regulamentos locais. Lavar as lamínulas uma vez com ultra-pura cultura de tecidos de água-grade, em seguida, adicionar 75-100 ml de água para o recipiente. Lamelas podem ser lavados várias vezes se a água ficar turva. Agitar suavemente à temperatura ambiente durante a noite sobre um conjunto agitador orbital durante não mais de 185 rpm.
  6. Repita a sequência acima de ácido nítrico / água de grau de cultura de tecido por dia para um total de 3 dias.
  7. Decantar a finalgrau de cultura de tecido de água e adicionar acetona o suficiente para conseguir cobrir as lamelas.
  8. Decantar este acetona e dispor adequadamente.
  9. Transferir para um lamelas 150 milímetros prato de vidro de Petri. Adicionar acetona o suficiente para conseguir cobrir as lamelas. Garantir as lamelas são em uma única camada no prato.
  10. Permitir que a acetona evapore durante a noite em um exaustor.
  11. Lamelas assar em um forno de secagem a 180 ° C durante 1,5 horas para esterilizar.

3. Preparação de Lamelas para a Cultura

  1. Um dia antes da dissecção, adicionar uma vidro lamela (preparado tal como descrito acima) a cada poço de uma placa de cultura de 24 poços de tecido usando uma técnica estéril. Adicionar 200 uL de solução de poli-D-lisina estéril (100 mg / ml em 0,5 M de tampão Tris, pH 8) a cada poço e armazenar a placa a 4 ° C durante a noite.
  2. O dia da dissecção, e idealmente, antes de iniciar a dissecção, aspirar a solução de poli-D-lisina de cada poço e lavar cada cavidade 5 vezescom água de grau estéril de cultura de tecidos.
  3. Adicionar 200 uL de glucose-baixo DMEM a cada placa e armazenar em 37 ° C incubadora. Aproximadamente 1 hora antes de as células em placas, remover-glucose baixo DMEM e adicionar 250 meio C2 uL por poço. Placas de armazenar a 37 ° C sob 5% de CO 2 até que as células estão prontas para ser revestido.

4. Dissecção e isolamento do gânglio cervical superior

  1. Culturas dissociadas de neurónios simpáticos são geralmente preparadas por dissociação de gânglios cervicais superiores (SCG), colhidas a partir de pré-natal (dia embrionário 19-21) crias de rato, porque há menos células gliais. No entanto, este mesmo protocolo pode ser utilizado com sucesso com iniciais pós-natais filhotes (1 a 3 dias de idade) de ratos ou crias de rato perinatal.
  2. Euthanize rato grávida via inalação de CO 2. Raspar o abdômen e lavar a pele com etanol 70%. Remover os cornos uterinos sob condições estéreis e colocar os cornos uterinos em 150 milímetros uma placa de Petri estéril. Evitardanificar os intestinos ou outros órgãos internos da barragem durante a dissecção.
  3. Coloque a placa de Petri com os filhotes em uma bandeja de gelo para anestesiar os filhotes embrionárias. Dissecar os embriões livres do corno uterino e da membrana amniótica. Cortar o cordão espinhal de cada filhote ao longo da linha média sob o ombro para sacrificá os filhotes. Isto também corta a veia cava, o que reduz o sangramento da artéria carótida durante a dissecção do SCG. Uma vez dissecada livre da trompa uterina, os embriões colocar num estéril de Leibovitz meio L-15 (ou qualquer meio de ar tamponada) suplementado com penicilina e estreptomicina.
  4. Colocar os embriões de costas sobre uma placa de Petri 150 milímetros meio-cheio com Sylgard. Usando estéreis 20 agulhas de calibre, prender o tórax ea cabeça, delicadamente a hiperextensão do pescoço, o que facilita a dissecção da SCG.
  5. Faça uma incisão na linha média ao longo do pescoço ao nível das clavículas para revelar as glândulas submandibulares. Remover as glândulas utilizando fórceps finos (nó. 4 ou não. 5 Dumont) para expor a camada muscular.
  6. Use a pinça fina para cortar o músculo esternocleidomastóideo perto da clavícula. Em seguida, levante com cuidado e incisão no músculo omo-hióideo ao lado da traquéia. Este músculo é muito fina, por isso evite cortar demasiado profundamente para evitar rasgar a artéria carótida subjacente e SCG. Uma vez que estas camadas musculares são removidos, a artéria carótida e no nervo vago deve ser claramente visíveis.
  7. A SCG fica logo abaixo da bifurcação da artéria carótida. Usando fórceps finos (No. 4 ou não. 5), sem corte dissecar tecido afastado de ambos os lados da artéria carótida para expor o gânglio. Usando 2 fórceps finos, agarrar a artéria carótida logo acima e abaixo das extremidades rostral e caudal da SCG, respectivamente, para remover a secção da artéria carótida deitado acima do SCG, bem como a SCG si. É provável que o gânglio nodoso, que se encontra ao lado da SCG, nesta fase do desenvolvimento, também irá ser removido neste passo. Os gânglios nodosos pode ser identified pela sua forma redonda e do nervo vagai grande projecta a partir dele. Este encontra-se junto a um dos ramos da artéria carótida. Em contraste, a SCG é amendoada e encontra-se directamente sob a bifurcação da artéria carótida. Colocar o tecido dissecado em um prato de cultura estéril 35 milímetros contendo L-15 de médio e antibióticos. Retire a SCG de todos os filhotes antes de avançar para as próximas etapas.
  8. Usando fórceps finos, suavemente separar o SCG a partir da artéria carótida e quaisquer outros tecidos removidos durante a dissecção (particularmente o nervo vago e gânglio nodoso). Use fórceps finos para remover a cápsula a partir de gânglios. Isto reduz grandemente o número de células não neuronais em cultura. Transferir a gânglios para outro prato milímetros estéril contendo 35 L-15 médio.
  9. Para dissociar a SCG, remover o meio de L-15 e substituir com 2 ml de colagenase (concentração final 1 mg / ml) / dispase (concentração final de 5 mg / ml) em cálcio e magnésio livre de Hank solução de sal equilibrada. Incubaçãote a 37 ° C durante 40 minutos.
  10. Transferir a SCG para um tubo de 15 ml estéril centrífuga cónica e levar o volume até 10 ml com L-15 suplementado com BSA (concentração final de 1-2 mg / ml). Centrifugar a 200 X g à temperatura ambiente durante 5 minutos. Descartar o sobrenadante e lava-se mais uma vez com L-15 suplementado com BSA.
  11. Após a segunda lavagem, remover toda a L-15 e ressuspender o gânglios em ~ 2 ml de meio de C2. Tritura-se as células utilizando um incêndio-polido pipeta dobrado ponta, certificar-se a pipeta é revestida com BSA/L15 antes trituração para minimizar aderência de células para o vidro. Tritura-se suavemente vezes 3-4. Deixe as grandes aglomerações repousar cerca de 1 minuto e transferir a suspensão de células para um tubo cónico de 15 ml. Adicionar mais mídia C2 para o restante SCG e triturar. Depois de deixar assentar os aglomerados, transferir a suspensão de células a partir da trituração segundo para que recolhidas após a trituração em primeiro lugar. Repetir este processo várias vezes até que o são na maior parte dos gânglios dissociados. Discard quaisquer aglomerados restantes após a trituração quarto.
  12. Para as células dissociadas de uma ninhada de crias de rato (tipicamente 12-16 filhotes) e levar o volume total do meio no suspensão de células para 8-10 ml por adição de meio C2 adicional. Suavemente ressuspender as células utilizando uma pipeta e remover uma pequena alíquota para determinar a densidade de células. Ajustar o volume da suspensão de células para conseguir 2X a densidade celular desejada na cultura e, em seguida, sendo certo para manter as células em suspensão, alíquota de 250 ml de suspensão de células por poço. Para estudos morfométricos do crescimento dendrítico, nós, células tipicamente em placas a baixa densidade (~ 5 x 10 células por poço 4) em placas de 24 poços.
  13. Nosso laboratório incuba culturas Scg em dessecadores de vidro ao invés de diretamente em uma incubadora de CO 2. Fazemos isso porque neurónios simpáticos cultivadas em meio livre de soro um melhor desempenho com um pouco maior concentração de CO 2 (cerca de 6,5%). Além disso, não usamos antibióticos em omeios ur, uma vez que inibe o crescimento de neurites e culturas mantendo no dessecadores parece minimizar a propagação da contaminação se desenvolve em um subconjunto das culturas. Usando este sistema, é rotineiramente manter culturas SCG até 8 semanas. Uma vez revestidos, culturas SCG são colocados sobre a placa de porcelana exsicador em dessecadores de vidro que contêm água estéril no fundo. Aproximadamente 120 ml de CO 2 é injectada no exsicador antes da selagem-la fechada e colocando o exsicador inteiro em um conjunto incubadora para 35,5 ° C.

5. Alimentação e manutenção de culturas

  1. As culturas são geralmente alimentados 3 vezes por semana, com a troca meios primeira ocorrendo 24 horas após o plaqueamento. Usando uma pipeta de ponta dobrada estéril, suavemente retirar cerca de metade dos meios de comunicação por poço. Usando uma pipeta limpa dobrada ponta estéril, substituir o volume do meio removido com C2 fresco.
  2. Para eliminar células não-neuronais a partir da cultura, o agente anti-mitótico cytosine-D-arabinofuranoside (ARA-C, concentração final 1-2 uM) é tipicamente adicionada ao meio de cultura no primeiro meios de troca (eg, 24 horas após o plaqueamento) durante 48 horas. Esta concentração de ARA-C é geralmente suficiente para remover todas as células não neuronais. Se o tratamento ARA-C adicional é necessária, recomenda-se que estes ser feito a cada alimentação outro para minimizar os efeitos tóxicos sobre os neurónios.

6. Induzir o crescimento dendrítico com Matrigel ou BMP-7

  1. Para induzir o crescimento dendrítico, Matrigel ou BMP-7 é adicionada às culturas após células não-neuronais foram eliminados e os níveis de ARA-C nas culturas são significativamente reduzidos. Tipicamente, adiciona Matrigel ou BMP-7 para o meio no dia 5, in vitro, mas o crescimento dendrítica pode ser induzida por Matrigel ou BMP-7 adicionado em qualquer ponto de tempo in vitro. Matrigel ou BMP-7 é adicionado ao meio de C2 e as culturas são alimentados como descrito acima.
  2. Matrigel e BMP-induzida crescimento dendrítico é o tempoe dependente da concentração. Para os efeitos máximos, Matrigel é adicionado a C2 a uma concentração final de 50-75 ug / ml; BMP-7 é adicionado ao meio de C2 a uma concentração final de 50 ng / ml. As concentrações de Matrigel maior do que 100 ug / ml ou BMP-7 concentrações superiores a 100 ng / ml foram anotados para causar toxicidade neuronal. Processos dendríticas (como determinada por critérios morfológicos) tornar-se aparente de aproximadamente 48 horas após a exposição inicial de Matrigel ou BMP-7 em concentrações maximamente eficazes. Para induzir o crescimento dendrítico robusto, as culturas são alimentados com BMP-7 contendo o meio em cada alimentação. Resultados equivalentes foram obtidos utilizando BMPs 2, 4, 5 e 6 em concentrações comparáveis ​​20,21.

7. Análise imunocitoquímica da BMP-7-induzida crescimento dendrítico

  1. Quando o grau desejado de arborização dendrítica tenha sido alcançado, as culturas são fixadas usando paraformaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1 M. A melhor fixação é umchieved substituindo metade do meio a no poço com paraformaldeído a 4% e repetindo este passo 3-5 vezes ao longo de 10-15 minutos.
  2. Enxaguar as culturas, substituindo meia paraformaldeído a 4% com tampão fosfato salino (PBS) e repetindo este passo três vezes ao longo de 10 - 15 minutos.
  3. Remover todo o PBS e adicionar 200 uL de Triton 0,1% X-100 em PBS a cada poço, durante 5 minutos à temperatura ambiente para permeabilizar as células.
  4. Remover solução de Triton por aspiração e adicionar 200 uL por poço de solução tampão de bloqueio (PBS suplementado com BSA a 3-5% e soro de cabra a 1%). Incubar durante 20-30 minutos à temperatura ambiente.
  5. Remover o tampão de bloqueio e adicionar o anticorpo primário, microtúbulo proteína associada-2 (MAP2) diluído a 1:2000 - 1:5000 em tampão de bloqueio. Incubar as culturas durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
  6. Remover a solução de anticorpo primário, lavar as culturas com PBS três vezes ao longo de 15 minutos à temperatura ambiente.
  7. Incubar as culturas com o anticorpo secundário diluído em PBS suplementado com BSA a 1% durante 1-2 horas à temperatura ambiente no escuro.
  8. Remover a solução de anticorpo secundário e lavar as culturas com PBS três vezes ao longo de 10-15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
  9. Lamelas de montagem sobre lâminas lado das células para baixo em uma gota de meio de montagem aquoso com o pH apropriado para o fluorocromo marcado para o anticorpo secundário. Manter as lâminas à temperatura ambiente durante a noite para permitir que o meio de montagem seco. Lâminas Armazenar a 4 ° C até de imagem.
  10. Permitir que os slides para equilibrar a temperatura ambiente antes de imagem. Aquisição de imagens fluorescentes, usando um microscópio de contraste de fase equipado para epifluorescência. Tipicamente, o mandril dendrítica inteira de um único neurónio pode ser capturada utilizando uma objectiva 20X e filtros adequados.

8. Os resultados representativos

Neurônios simpáticos dissociadas do SCG de ra perinatalts e cultivadas na ausência de soro e as células gliais ganglionar falhar para estender MAP2 processos imunopositivas (Figura 1), mas sim, tipicamente se estendem apenas um único processo axonal 14,15. A exposição a BMP-7 (Figura 1) ou Matrigel induz a formação de numerosos processos que satisfazem os critérios morfológicos, bioquímicos e funcionais de dendrites 17,18. A atividade dendrite de promoção de qualquer Matrigel ou BMP-7 é a concentração e tempo-dependente 17,18,20. Crescimento dendrítico máxima é observada utilizando concentrações de Matrigel entre 50 e 75 ug / ml ou BMP-7 entre 30 e 100 ng / ml, e uma meia-máximas efeitos são tipicamente observadas em BMP-7 concentrações de ~ 2 ng / ml. No entanto, alterações significativas no crescimento dendrítica pode ser detectada com BMP-7 concentrações tão baixas como 300 pg / ml. A resposta a qualquer dendrítica Matrigel ou BMP-7 é relativamente lento, com <50% dos neurónios formando um segundo processo dentro de 24 horas após a exposição a qualquer dendrite-p romover agente. No entanto, no prazo de 3 dias após a inicial BMP-7 exposição, praticamente todos os neurónios responder a Matrigel maximamente eficaz ou BMP-7 concentrações. O número de neurónios por dendritos continua a aumentar com a exposição contínua a BMP-7, com a maioria das alterações que ocorrem durante os primeiros 10 dias de tratamento. Após 4 semanas, BMP-7-tratados neurónios têm tipicamente 6-8 dendritos primários que exibem secundária, terciária e quaternária, mesmo ramos dendríticas 17. Este aumento na mandril dendrítica ocorre na ausência de qualquer alteração significativa no crescimento axonal, e respostas dendríticas comparáveis ​​podem ser atingida utilizando concentrações semelhantes de BMPs 2, 4, 5 ou 6 20,21. Crescimento dendrítico também pode ser provocada por co-cultura de neurónios simpáticos com endógenos ganglionares células gliais 15,22, no entanto, a resposta dendrítica é significativamente mais lenta sob estas condições.

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Figura 1. BMP-7 promove o crescimento dendrítico nas culturas de neurônios simpáticos. Células não-neuronais foram eliminados do SCG culturas por tratamento com anti-mitótico durante 48 hr início no dia 2 in vitro. Começando no dia 5, in vitro, as culturas foram tratadas com meio de controlo (A) ou meio suplementado com BMP-7, 50 ng / ml (B). No dia 11, in vitro (após 5 dias de tratamento BMP), as culturas foram imunocoradas com mAb contra MAP2, uma proteína que se encontra principalmente no dendritos e somata neuronal. Como mostrado na representativos fotomicrografias de fluorescência, os neurónios cultivados sob condições de controlo não têm dendritos como evidenciado pela falta de MAP-2 dendritos imunopositivas processos (A), em contraste, os neurónios expostos a BMP-7 (B) têm tipicamente vários afunilada MAP-2 imunopositivas dendritos.

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Discussão

As vantagens deste modelo incluem: (a) as culturas são compostos de uma população homogénea de neurónios simpáticos desprovidas de outros tipos de células 17,23; (b) os requisitos do factor de crescimento de neurónios simpáticos estão bem estabelecidos, o que permite o uso de meio definido, e uma variedade de meios definidos, e substratos funcionar bem para crescimento e manutenção de neurónios simpáticos 23, (c) neurónios nestas culturas responder uniformemente para a actividade promotora de dendr...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi suportado pelo financiamento do National Institutes of Health (R21 NS45037 subsídios e R01 ES014901).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de catálogo Comentários
Lamínulas Bélico 1943-10012 12 Coverslip Rodada mm # Espessura 1, vidro alemão
Bent ponta pipetas Bélico 1273-50003
Poli-D-lisina Sigma P0899-100mg Banco de solução a 1 mg / ml
Água destilada Gibco 15230
Multa fórceps Dumont n. 4 e 5 Belas Ferramentas Ciência (FST) 11252-30 11241-30
Calibre 20 agulhas Becton Dickinson 305176
L-15 de Leibovitz médio Invitrogen 11415
Colagenase Worthington 4176 1 mg / ml
Dispase Roche 04942078001 5 mg / ml
Solução salina equilibrada de Hank (-Ca,-Mg) Invitrogen 14185-052
DMEM baixa glicose Invitrogen 11885
L-Glutamina Invitrogen 25030 20 mM
Insulina / Transferrina / Selenium Invitrogen 51500-056 100X
De ácidos gordos livre de BSA Calbiochem 126609
NGF Bioproducts Harlan 5017
Ham meio nutriente F-12 (F-12) Invitrogen 11765
Citosina arabinósido Sigma C1768
Matrigel BD Biosciences 356234 Evite a repetição de ciclos de congelamento e descongelamento
BMP-7 R & D Systems Curis, Inc. 345-BP BMP7-07h BMPs 4, 5 e 6 funcionam igualmente bem como BMP-7 e por vezes são mais fáceis de obter comercialmente
Paraformaldeído Sigma P6148
Triton X-100 Pescador BP151-500
Rato anti-rato MAP2 anticorpo Sternberg monoclonais Inc. SMI52 1/5000
Alexa Fluor 546 cabra anti-rato Invitrogen A11003 1/10000
Meios de montagem Prolongar Sondas kit Antifade Molecular P7481

Referências

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